馬鈴薯是全球第四大糧食作物，其塊莖貯藏蛋白必需氨基酸（EAA）含量高、功能特性好，被廣泛認為是最有價值的植物蛋白之一。然而，與小麥面筋蛋白相比，馬鈴薯塊莖貯藏蛋白含量較低且缺乏可形成分子間二硫鍵的半胱氨酸對，導致馬鈴薯粉團的粘度差，阻礙了其在食品加工領(lǐng)域中的應用。

2024年1月23日，中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)基因研究所黃三文院士團隊、中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所徐建飛研究員團隊和云南師范大學尚軼教授團隊在Food Chemistry ( IF 8.8 )在線發(fā)表了“Deep learning-based characterization and redesign of major potato tuber storage protein” 研究成果。該研究使用基于人工智能（Artificial Intelligence, AI）蛋白設(shè)計策略，在馬鈴薯主要貯藏蛋白Patatin表面引入多個半胱氨酸位點，促進了由二硫鍵連接的聚合物形成，并顯著提高馬鈴薯面團的粘性和營養(yǎng)成分。青蓮百奧非常榮幸參與了該研究中二硫鍵檢測相關(guān)工作。

文章標題：Deep learning-based characterization and redesign of major potato tuber storage protein

發(fā)表期刊：Food Chemistry

影響因子：8.8

發(fā)表時間：2024年1月23日

研究思路

1. 馬鈴薯貯藏蛋白含量、淀粉量測定以及結(jié)構(gòu)特征分析；

2. AlphaFold2分析貯藏蛋白Patatin17的二聚體結(jié)構(gòu)；

3. 酵母雙雜交和分裂熒光素酶檢測Patatin17二聚體形成；

4. 蛋白質(zhì)設(shè)計工具在Patatin17二聚體結(jié)構(gòu)表面引入六個半胱氨酸；

5. 利用質(zhì)譜技術(shù)對Patatin17二聚體進行二硫鍵確證；

6. 評估Patatin17-V6多聚物在馬鈴薯粉面團上的加工效果。

研究結(jié)果

一、塊莖貯藏蛋白的主要特性及結(jié)構(gòu)分析

為了研究馬鈴薯貯藏蛋白的特性，研究人員測定了21份四倍體和195份二倍體品系的馬鈴薯塊莖蛋白含量，發(fā)現(xiàn)二倍體馬鈴薯蛋白含量差異較四倍體馬鈴薯更為顯著（圖1A）。又測量了28份二倍體品系馬鈴薯的塊莖淀粉含量，發(fā)現(xiàn)這些二倍體的塊莖蛋白與淀粉含量之間存在預期的相關(guān)性(圖1B)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了塊莖干物質(zhì)生物合成過程中，資源分配和內(nèi)部競爭受到嚴格的調(diào)控。采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察發(fā)現(xiàn)與小麥蛋白相比，馬鈴薯塊莖蛋白不能有效地粘附淀粉顆粒（圖1C-D）。

圖1：塊莖貯藏蛋白的主要特性及結(jié)構(gòu)分析

Patatins，一種主要的塊莖貯藏蛋白，位于液泡中的非特異性脂肪酶。盡管Patatin17（Pat17）有一種晶體結(jié)構(gòu)，但尚未確定Pat17是否在塊莖中作為二聚體發(fā)揮作用。研究人員進一步基于深度學習的蛋白結(jié)構(gòu)預測方法構(gòu)建了Pat17的二聚體模型，采用酵母雙雜交和分裂熒光素酶檢測法預測Pat17的相互作用。在Pat17二聚體模型中，發(fā)現(xiàn)Patatin17通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)形成同源二聚體（圖1F-G），并通過點突變實驗進一步驗證了該發(fā)現(xiàn)。

二、Pat17表面引入半胱氨酸促進聚合物形成

蛋白質(zhì)之間二硫鍵的形成對面團粘度至關(guān)重要，研究人員應用蛋白質(zhì)設(shè)計工具在Pat17序列中加入了六個半胱氨酸，四個半胱氨酸（C88、C148、C178和C382）位于Pat17的表面，另外兩個半胱氨酸（C220和C294）則在蛋白互作的內(nèi)部（圖2A-B）。為了檢測該蛋白變體之間是否能形成二硫鍵，研究人員在大腸桿菌中表達了Pat17-V6，并純化后進行SDS-PAGE和免疫印記檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在非還原條件下，Pat17可形成二聚體和多聚體。使用還原劑處理后，多聚體形式的Pat17可恢復為單體形式（圖2C-D）。

圖2：Patatin17二硫鍵的設(shè)計

三、質(zhì)譜分析驗證Pat17變體二硫鍵形成

接下來，從非還原條件下純化的Pat17-V6二聚體進行二硫鍵檢測?；谫|(zhì)譜分析，共鑒定出兩個二硫鍵C178-C178和C178-C382，它們交聯(lián)了Pat17-V6二聚體（圖3A-B）。其中，突變實驗發(fā)現(xiàn)A178C位點的單點突變使Patatin17在非還原條件下形成了二聚體，與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致（圖3C-D）。值得注意的是，雖然C220和C294在蛋白質(zhì)相互作用界面內(nèi)很接近（圖2B），但在該界面上并沒有形成二硫鍵，表明多個氫鍵的存在可能是影響二硫鍵形成的因素之一。

圖3：Patatin17多聚體中二硫鍵的確證

四、Pat17-V6聚合物提高了馬鈴薯面團的粘度

最后，研究人員評估了Pat17-V6多聚物在馬鈴薯粉面團上的加工效果。通過將馬鈴薯粉團與等量的Pat17或Pat17-V6混合。雖然添加 Pat17可提高樣品粘度，但添加 Pat17-V6對粘度的提升顯著高于添加Pat17（圖4A-B）。使用掃描電鏡評估不同處理條件下馬鈴薯面團微觀結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)以緩沖液（陰性對照）制備的馬鈴薯面團表面粗糙，淀粉顆粒不能粘附在一起；當馬鈴薯面團與Pat17混合時，顆粒表面比對照更光滑；當用Pat17-V6制備樣品時，觀察到最光滑和最緊密的顆粒（圖4C-E）。綜上結(jié)果表明，通過二硫鍵連接的Pat17-V6聚合物可以充當分子“膠水”，顯著改善馬鈴薯面團的加工特性和營養(yǎng)品質(zhì)（圖4F）。

圖4：Pat17-V6對馬鈴薯面團粘度和形態(tài)的作用

研究結(jié)論

研究人員利用AI蛋白質(zhì)設(shè)計技術(shù)，通過在馬鈴薯Pat17表面添加6個半胱氨酸，從而增加二硫鍵來提高其粘性和營養(yǎng)成分。該研究表明基于深度學習的蛋白質(zhì)設(shè)計策略不僅能夠有效地表征蛋白質(zhì)，而且能夠為未來的食物來源創(chuàng)造新的蛋白質(zhì)。