細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作為液體活檢的新星，引起了人們的興趣，用以補(bǔ)充癌癥篩查的不準(zhǔn)確性和組織活檢的侵入性。前列腺癌(PCa)是男性最常見(jiàn)的癌癥之一，而傳統(tǒng)的前列腺特異性抗原（PSA）檢測(cè)存在準(zhǔn)確性和侵入性問(wèn)題。為了克服這些限制，科學(xué)家們一直在尋找新的生物標(biāo)志物。

近日，寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科蔣軍輝教授團(tuán)隊(duì)&澳大利亞新南威爾士大學(xué)李勇教授團(tuán)隊(duì)，在《Advanced Science》上發(fā)表了一項(xiàng)題目為 “Proteomic Identification of Small Extracellular Vesicle Proteins LAMB1 and Histone H4 for Prostate Cancer Diagnosis and Risk Stratification”的突破性研究，通過(guò)無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)對(duì)來(lái)自不同前列腺癌細(xì)胞系的小細(xì)胞外囊泡（sEVs）樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以鑒定潛在的sEVs蛋白生物標(biāo)志物，并通過(guò)PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)、WB和ELISA對(duì)來(lái)自不同前列腺癌階段的人血漿和尿液樣本進(jìn)行驗(yàn)證。該研究揭示了sEVs蛋白LAMB1和Histone H4作為PCa診斷和風(fēng)險(xiǎn)分層的潛在生物標(biāo)志物。

研究策略

圖1：研究設(shè)計(jì)示意圖

結(jié)果速遞

一、LC-MS/MS鑒定PCa細(xì)胞系sEV蛋白潛在標(biāo)志物

利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)PCa細(xì)胞系（PC3、DU145、LNCaP和22Rv1）和正常前列腺上皮細(xì)胞系（RWPE-1）的sEVs，進(jìn)行了深入研究，共鑒定到1570種蛋白，其中878種蛋白被定量，表現(xiàn)出在不同前列腺癌細(xì)胞系和正常前列腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)差異。GO富集分析顯示，所有sEV樣本中，“細(xì)胞外外泌體”和“細(xì)胞外囊泡”成分豐富，這強(qiáng)調(diào)了sEVs及其在PCa中的重要作用。在所有五種細(xì)胞系sEVs中，發(fā)現(xiàn)了219種共有蛋白，133種sEV蛋白質(zhì)僅在PCa細(xì)胞系中表達(dá)，5種sEV蛋白質(zhì)僅在轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞系中表達(dá)。在超過(guò)50%的PCa樣本中篩選出20種潛在sEV蛋白（在轉(zhuǎn)移性PCa細(xì)胞系sEVs中高表達(dá)，而在局部原發(fā)性PCa細(xì)胞系或正常前列腺上皮細(xì)胞系sEVs中表達(dá)缺失或極低）進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2：PCa細(xì)胞系sEV蛋白的分析

二、PRM和WB技術(shù)驗(yàn)證不同階段PCa患者中潛在sEV蛋白

為了驗(yàn)證PCa細(xì)胞系中潛在的sEV生物標(biāo)志物，并評(píng)估其作為PCa患者診斷或風(fēng)險(xiǎn)分層標(biāo)志物的潛力，對(duì)來(lái)自不同疾病風(fēng)險(xiǎn)和分期的臨床樣本（健康對(duì)照組n=12，低風(fēng)險(xiǎn)PCa患者n=12，高風(fēng)險(xiǎn)PCa患者n=12，轉(zhuǎn)移性mPCa患者n=12）進(jìn)行了PRM靶向質(zhì)譜分析。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的sEV LAMB1表達(dá)在高風(fēng)險(xiǎn)組和轉(zhuǎn)移性PCa組之間存在顯著差異，而尿液樣本中的sEV Histone H4表達(dá)在高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組、對(duì)照組和轉(zhuǎn)移性組之間也存在顯著差異。提示LAMB1和Histone H4可能是候選生物標(biāo)志物。此外，sEV中包含大量非PCa細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)，這可能與生物樣本的來(lái)源有關(guān)。

通過(guò)WB進(jìn)一步驗(yàn)證了sEV蛋白LAMB1和Histone H4在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，但正常RWPE-1細(xì)胞與PCa細(xì)胞系中sEV蛋白表達(dá)存在顯著差異，這可能與不同細(xì)胞類(lèi)型通過(guò)自分泌或主動(dòng)分泌sEVs來(lái)調(diào)控鄰近或遠(yuǎn)距離細(xì)胞的機(jī)制不同有關(guān)。此外，對(duì)人血漿和尿液樣本的WB分析進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，但僅部分驗(yàn)證了LCMS/MS結(jié)果。但sEV蛋白在血漿和尿液中的表達(dá)水平不同，表明臨床樣本中sEV蛋白表達(dá)具有變異性。這些發(fā)現(xiàn)與PRM結(jié)果一致，為sEV蛋白LAMB1和Histone H4作為診斷標(biāo)志物的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

圖3：用PRM和WB驗(yàn)證PCa樣品中選定的sEV蛋白

三、Elisa驗(yàn)證血液和尿液中sEV蛋白LAMB1和Histone H4

sEV蛋白在PCa診斷和分層中的潛在臨床應(yīng)用。通過(guò)ELISA方法，在血漿和尿液樣本中分析了sEV蛋白LAMB1和Histone H4的表達(dá)水平，并與現(xiàn)有的血清PSA檢測(cè)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，LAMB1在mPCa患者中的表達(dá)顯著升高，其診斷準(zhǔn)確性高于血清PSA。同時(shí)，Histone H4能夠區(qū)分低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)PCa患者，其診斷價(jià)值也高于血清PSA。此外，將LAMB1和Histone H4與血清PSA結(jié)合使用，可進(jìn)一步提高診斷價(jià)值。這些結(jié)果提示，sEV蛋白LAMB1和Histone H4在PCa診斷和分層中具有潛在的臨床價(jià)值，并可能成為改進(jìn)現(xiàn)有診斷方法的候選生物標(biāo)志物。

圖4：PCa患者血漿和尿液中sEV蛋白LAMB1和Histone H4的臨床驗(yàn)證

四、LAMB1和組蛋白H4蛋白在人前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床相關(guān)性

通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）染色法分析了人組織樣本，以進(jìn)一步探討sEV蛋白在PCa中的臨床相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比，PCa組織中LAMB1和Histone H4蛋白的表達(dá)均增加。進(jìn)一步分析顯示，sEV LAMB1在血液中和Histone H4在尿液中的表達(dá)可能與PCa細(xì)胞分泌有關(guān)。此外，對(duì)手術(shù)期間獲取的PCa組織樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，LAMB1蛋白在轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)模式與其他組別存在顯著差異，且與血漿中sEV LAMB1的表達(dá)一致。然而，Histone H4在尿液sEV中的表達(dá)模式與PCa組織中的表達(dá)不一致，可能受其他因素影響。最后，通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)集的分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的LAMB1和Histone H4與PCa患者的不良預(yù)后和低生存率相關(guān)，提示這兩種sEV蛋白在PCa的診斷、預(yù)后和治療中具有潛在價(jià)值。

圖5：LAMB1和Histone H4在臨床PCa組織中的臨床關(guān)聯(lián)

研究結(jié)論

該研究通過(guò)外泌體（sEVs）蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了兩種具有高特異性和敏感性的蛋白標(biāo)志物：LAMB1和組蛋白H4，為前列腺癌的診斷和風(fēng)險(xiǎn)分層提供了新的生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)

[1] Pang B, Wang Q, Chen H, et al. Proteomic Identification of Small Extracellular Vesicle Proteins LAMB1 and Histone H4 for Prostate Cancer Diagnosis and Risk Stratification[J]. Advanced Science 2024 Apr 8: e2402509.