膿毒癥是由感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致生命威脅的器官功能障礙，是一個(gè)全球性的衛(wèi)生挑戰(zhàn)。目前缺乏有效的免疫調(diào)節(jié)療法來應(yīng)對膿毒癥的高死亡率和全球危機(jī)。目前根據(jù)臨床、實(shí)驗(yàn)室和分子分層因素，提出了對免疫反應(yīng)狀態(tài)、預(yù)后和治療反應(yīng)有參考價(jià)值的膿毒癥亞型。然而，由于對膿毒癥血漿蛋白質(zhì)組的了解不全面，無法確定膿毒癥宿主反應(yīng)的性質(zhì)以及對患者進(jìn)行最佳分層。
今年6月5日，牛津大學(xué)納菲爾德醫(yī)學(xué)系的研究團(tuán)隊(duì)在《Sci Transl Med》（IF:17.1）雜志上發(fā)表題為：《High-throughput mass spectrometry maps the sepsis plasma proteome and differences in patient response》的相關(guān)研究。該研究通過高通量串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)詳細(xì)描繪膿毒癥的血漿蛋白組，并識別導(dǎo)致患者響應(yīng)的因素，以期為膿毒癥的病理生理學(xué)理解和新治療方法提供更好的理解。
樣本（共1611例）：
因社區(qū)獲得性肺炎（CAP）或糞便腹膜炎（FP）而入住重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）的膿毒癥患者，并在他們?nèi)朐浩陂g連續(xù)采樣（n=1189名患者，1879個(gè)樣本）：這些患者被分為發(fā)現(xiàn)組和驗(yàn)證組；
另增加其他隊(duì)列作為比較組，包括需要血管加壓的膿毒癥臨床試驗(yàn)者（n=45名患者，154份樣本）、健康志愿者（HVs）（n=152人和樣本），以及與非感染性炎癥患者（n=149名患者，351份樣本）和非感染性ICU患者（n=76名患者，76份樣本）。
方法：該研究開發(fā)了一種高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，使用布魯克timsTOF Pro質(zhì)譜儀，對來自1611個(gè)個(gè)體的2612個(gè)血漿樣本在28個(gè)完全隨機(jī)的采集板上一批檢測，每天檢測100個(gè)樣本。
檢測結(jié)果：最終檢測到2782個(gè)蛋白質(zhì)，數(shù)據(jù)預(yù)處理后得到來自1598個(gè)個(gè)體的2575個(gè)樣本中的269個(gè)蛋白質(zhì)。
主成分分析（PCA）表明，主成分（PC）1形成了從HVs和選擇性手術(shù)術(shù)前病例到術(shù)后病例和非感染性危重癥，再到膿毒癥的樣本梯度（圖1B）。PC1在不同樣本隊(duì)列中呈現(xiàn)出梯度，其中抗微生物體液反應(yīng)、細(xì)胞趨化、對外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)（膿毒癥/重癥）和脂蛋白代謝過程（非膿毒癥對照組）的載荷最高。PC2涉及B細(xì)胞活化和Fc受體信號通路的調(diào)控（圖1D）。該研究還利用隊(duì)列中的所有樣本推導(dǎo)出了蛋白質(zhì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，將184個(gè)蛋白質(zhì)分成16個(gè)共表達(dá)模塊，這些模塊因比較隊(duì)列而異，分別富集于急性期蛋白（藍(lán)色模塊，膿毒癥患者較高）、血漿脂蛋白組裝（黃色，HVs患者較高）、血小板脫顆粒（棕色，膿毒癥患者較高）和免疫球蛋白（黑色，膿毒癥患者較高；紫色，非感染者較高；紫色，在非感染ICU患者中較高，洋紅色，在膿毒癥和非感染ICU患者中較高）（圖1E）。
圖1 血漿蛋白質(zhì)組PCA分析和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
該研究繼續(xù)研究膿毒癥與其他特征樣本的蛋白質(zhì)豐度差異和通路富集情況（圖2A）。在發(fā)現(xiàn)組和驗(yàn)證組的六個(gè)膿毒癥-對比組對比中，發(fā)現(xiàn)有11種蛋白質(zhì)在所有對比中含量不同，所有這些蛋白質(zhì)在膿毒癥中含量最高。這些蛋白質(zhì)涉及急性期反應(yīng)、組織損傷保護(hù)、中性粒細(xì)胞功能、細(xì)胞因子產(chǎn)生以及半乳糖代謝相關(guān)蛋白（圖2B-D）。根據(jù)蛋白差異構(gòu)建基于彈性網(wǎng)絡(luò)回歸算法的機(jī)器學(xué)習(xí)模型，可以區(qū)分驗(yàn)證人群,AUC=100.0%(99.9 to 100.0%)(膿毒癥患者vs健康），AUC=96.9%(94.6 to 99.2%)（膿毒癥患者vs術(shù)后）。這說明蛋白質(zhì)差異在不同患者隊(duì)列中是穩(wěn)定的。
圖2 膿毒癥特異性蛋白質(zhì)組反應(yīng)
該研究繼續(xù)探究了特定血漿蛋白是否與膿毒癥反應(yīng)的特定臨床特征有關(guān)。就個(gè)體血漿蛋白豐度而言，確定了一組蛋白[包括PTGDS（前列腺腺蛋白D2合成酶）、B2M（β2微球蛋白）、CFD（復(fù)合因子D）、LCN2、VWF、COL6A1、USP15、MMP2、COL1A2、CD14、PLTP（磷脂轉(zhuǎn)移蛋白）和CRP]，這些蛋白與反映更嚴(yán)重疾病的臨床變量高度相關(guān)，包括總SOFA、急性生理學(xué)和慢性健康評估（APACHE）、休克或腎功能衰竭的發(fā)生以及凝血酶原時(shí)間（圖3）。
圖3 膿毒癥血漿蛋白質(zhì)組與臨床特征的相關(guān)性
使用從所有隊(duì)列中確定的蛋白質(zhì)共表達(dá)模塊，我們發(fā)現(xiàn)特定的模塊與比較組對比結(jié)果和特定臨床變量顯著相關(guān)（FDR<0.05）（圖2A和4A-C）。蛋白質(zhì)組特征對死亡率的影響在許多情況下是通過器官功能障礙介導(dǎo)的，其中八個(gè)模塊中有六個(gè)影響了結(jié)果，既直接影響又通過至少五個(gè)器官系統(tǒng)的SOFA評分間接影響，涉及止血、內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)節(jié)、脂蛋白組裝、免疫球蛋白和中性粒細(xì)胞脫顆粒（圖4D）。
圖4 膿毒癥血漿蛋白質(zhì)組內(nèi)的差異
為了定義膿毒癥亞表型，使用所有時(shí)間點(diǎn)的膿毒癥發(fā)現(xiàn)隊(duì)列的蛋白定量進(jìn)行聚類分析，確定了三個(gè)亞組，將其稱為基于膿毒癥血漿蛋白質(zhì)組的聚類（SPC1/2/3）。總的來說，當(dāng)將SPC1與SPC2或SPC3與HV進(jìn)行比較時(shí)，血漿蛋白差異豐富（膿毒癥患者的SPC1、SPC2和SPC3分別為81、74和55種蛋白），包括SPC1特異性的免疫球蛋白和載脂蛋白，SPC1中吞噬作用的富集和B細(xì)胞活化的正調(diào)控，以及SPC2中免疫球蛋白的豐度較低。
圖5 發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中的SPCs
為了驗(yàn)證和進(jìn)一步描述這些亞組，根據(jù)膿毒癥發(fā)現(xiàn)隊(duì)列開發(fā)了SPC預(yù)測模型（AUC)≥95%，靈敏度和特異性≥85%），并將該模型應(yīng)用于膿毒癥驗(yàn)證隊(duì)列（來自394名患者的624個(gè)樣本）以推導(dǎo)出SPC分型結(jié)果，它重現(xiàn)了死亡率和嚴(yán)重程度測量值的關(guān)聯(lián)結(jié)果（圖6A-B）。進(jìn)一步測試了基于少量信息蛋白生物標(biāo)記物的群集預(yù)測，使用八個(gè)預(yù)測因子推導(dǎo)出了一個(gè)新的最小彈性網(wǎng)模型，該模型成功地預(yù)測了HV的集群（靈敏度為72.7%，特異度為94.2%）。
SPC1的特征是血漿中免疫反應(yīng)蛋白的豐度更高，包括特異性細(xì)胞因子和免疫球蛋白，以及更多的膠原和ECM成分，這意味著這些患者的組織損傷程度更大（圖6F）。SPC1的脂蛋白代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相對下調(diào)。相比之下，SPC2的免疫球蛋白豐度和B細(xì)胞信號通路蛋白較低，而在SPC3中，白細(xì)胞介素信號和細(xì)胞因子濃度相對降低。
圖6 基于膿毒癥血漿蛋白組的集群（SPCs）的驗(yàn)證和分子特征
利用矩陣分解法（30）將837份樣本（649名患者）的膿毒癥血漿蛋白質(zhì)組學(xué)（MS）與配對的白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA測序（RNA-seq））整合在一起，試圖最大限度地提高膿毒癥血漿蛋白質(zhì)組學(xué)（MS）的信息量。接著確定了哪些成分與疾病嚴(yán)重程度、膿毒癥來源、臨床協(xié)變量和疾病亞型有關(guān)聯(lián)，并重點(diǎn)研究了有顯著蛋白質(zhì)貢獻(xiàn)的76個(gè)成分。與SPCs關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的成分與富含ECM和新陳代謝的蛋白質(zhì)（USP15、COL1A2、MMP2和VWF）、補(bǔ)體和免疫球蛋白變鏈有關(guān)（圖7D）。
圖7 血漿蛋白質(zhì)組學(xué)與白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的整合
該研究進(jìn)一步通過分析1016名患者（1361個(gè)樣本）的SPC和白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組衍生膿毒癥反應(yīng)特征（SRS），探討了血漿蛋白質(zhì)組學(xué)和白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)衍生的膿毒癥亞表型之間的關(guān)系。在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中 70%的SPC1患者也被分配到SRS1，而在SPC2和SPC3中分別為37%和34%（圖8A-B）。確定了SRS組間不同豐度的蛋白質(zhì)（圖8C），其中一些與區(qū)分SPC1和SPC2+3的蛋白質(zhì)重疊（圖8D）。最后，鑒于SRS1和SPC1都與不良預(yù)后相關(guān)（圖8E），該研究測試了這兩種分類是否可以結(jié)合起來，以進(jìn)一步為風(fēng)險(xiǎn)分層提供信息。結(jié)果表明同時(shí)被分配到SRS1和SPC1的患者（約占11%的患者）死亡率最高，28天時(shí)為33.3%，而SPC3非SRS1患者（約43%）的死亡率最低，為10.4%（圖8F）。
圖8 蛋白質(zhì)組（SPC）和轉(zhuǎn)錄組（SRS）患者亞組的關(guān)系
文章通過對大量膿毒癥患者血漿樣本的高通量質(zhì)譜分析，成功繪制出膿毒癥血漿蛋白組的全景，并識別出與疾病進(jìn)程和患者響應(yīng)相關(guān)的特征蛋白。這一研究不僅揭示了膿毒癥的亞型，還提出了潛在的生物標(biāo)志物，并為實(shí)現(xiàn)膿毒癥的個(gè)體化醫(yī)療提供了新的機(jī)會。
參考文獻(xiàn)
[1]Mi Y, Burnham KL, Charles PD, et al. High-throughput mass spectrometry maps the sepsis plasma proteome and differences in patient response. Sci Transl Med. 2024;16(750):eadh0185. doi:10.1126/scitranslmed.adh0185
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