三陰性乳腺癌（TNBC）是復發(fā)率和死亡率最高的乳腺癌亞型，化療一直是其一線治療方法，但在轉移性TNBC中傳統(tǒng)化療藥物效果有限。進入外周血的循環(huán)腫瘤細胞（CTC）具有免疫逃逸并定植發(fā)展為轉移灶的潛力，尤其是具有干性的多個CTC集群（CTC簇）。一些介導細胞粘附和干性的糖蛋白能驅動CTC簇的形成，然而糖基化在CTC簇形成中的作用尚未完全闡明。

2023年9月，美國西北大學范伯格醫(yī)學院的研究團隊對敲除特定基因的乳腺癌細胞糖蛋白唾液酸化水平進行了糖基化蛋白質組學檢測，發(fā)現(xiàn)并驗證了ST6GAL1下調能引起CTC簇糖蛋白末端唾液酸化喪失，導致細胞以休眠的方式逃避化療發(fā)生轉移定植。糖基化蛋白質組學篩選發(fā)現(xiàn)ST6GAL1的底物糖蛋白PODXL是對抗CTC簇化療逃逸與轉移的候選靶點。

【文章標題】Dynamic Glycoprotein Hyposialylation Promotes Chemotherapy Evasion and Metastatic Seeding of Quiescent Circulating Tumor Cell Clusters in Breast Cancer

【發(fā)表期刊】Cancer Discovery

【影響因子】29.497

【發(fā)表時間】2023年9月

【發(fā)表單位】美國西北大學范伯格醫(yī)學院

研究策略

結果速遞

一、化療逃逸性CTC簇預示乳腺癌不良預后

對162名III-IV期乳腺癌患者進行血樣采集，并在3個月后的放療評估時對其中一半患者再次采血。約半數(shù)二次采血的患者在兩次采血間隔接受化療。計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CTC數(shù)量多與患者不良預后相關，化療患者CTC簇數(shù)量顯著增加，且CTC簇數(shù)量增加或穩(wěn)定高計數(shù)的患者預后更差（圖1C）。

圖1 化療與CTC簇的形成和α2,6-SA、ST6GAL1的丟失相關

二、CTC簇中α2,6-唾液酸化缺失與PAX治療相關

流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)CTC簇中α2,6-唾液酸（α2,6-SA）水平顯著低于單個CTC；化療或紫杉醇（PAX）治療后CTC簇中α2,6-SA水平特異性降低（圖1E）。使用人源性組織異種移植（PDX）模型發(fā)現(xiàn)PAX治療導致荷瘤小鼠肺轉移增加（圖I,J）、CTC簇比例增加（圖1L）和α2,6-SA水平，即接骨木凝集素（SNA）信號降低（圖1M,N）。

三、α2,6-SA或ST6GAL1的缺失促進CTC簇形成，導致PAX處理逃逸

懸浮細胞成團實驗顯示低α2,6-SA化促進腫瘤細胞成簇（圖2A）。敲除介導細胞粘附的CD44后，細胞α-2,6-SA水平和ST6GAL1表達增加，ST6GAL1抑制腫瘤細胞成簇能力（圖2B）。

檢測人ST6GAL1 KO（ST6KO）腫瘤細胞（MDA-MB-231和PDX）和小鼠ST6KO腫瘤細胞（4T1）的糖基化蛋白質組，發(fā)現(xiàn)ST6KO MDA-MB-231細胞中糖蛋白α2,6-SA化完全消失，流式細胞術等方法平行檢測驗證了該結果（圖2B）。

PAX以劑量依賴的方式降低PDX CTC-092和MDA-MB-231細胞的α2,6-SA（圖2D），并在25 μg/mL的低劑量下促進耐藥CTC-092細胞成簇（圖2E）。α2,6-SA低的細胞對PAX更為耐受（圖2F），表明α2,6-SA缺乏與細胞PAX抗性和/或逃逸有關，且對比其他化療藥物發(fā)現(xiàn)這種耐藥具有特異性。

圖2 α2,6-SA和ST6GAL1抑制細胞成簇并賦予細胞PAX敏感性

四、ST6GAL1缺失誘導CTC簇停留在靜止期（G0）以逃避化療

Ki-67染色顯示與單一CTC相比，CTC簇增殖能力減弱（圖3A,F,G），化療后G1-G0期的細胞增加更多（圖3D），且DNA含量與α2,6-SA含量正相關（圖3E,F）。RNA測序后的富集分析發(fā)現(xiàn)ST6KO細胞中細胞周期被抑制，干擾素反應、細胞粘附、上皮-間質轉化和炎癥反應上調（圖3H-J）。分析細胞生長和細胞周期，發(fā)現(xiàn)ST6KO細胞的融合性生長速度延遲（圖3K），靜止期（G0）細胞比例增加（圖3M,N），形成的克隆更小。在競爭增殖試驗中，ST6WT細胞占優(yōu)勢，但低劑量PAX處理下ST6KO細胞占優(yōu)勢。低α2,6-SA CTC的乳腺癌患者無遠端轉移生存期較差，ST6GAL1 mRNA、蛋白高表達患者預后均較良好。這些結果表明缺乏ST6GAL1的腫瘤細胞在G0期靜止，具有化療逃逸優(yōu)勢，能導致患者不良預后。

圖3 缺乏α2,6-SA和ST6GAL1與CTC簇的靜止有關

五、播種期CTC和播散性腫瘤細胞的α2,6-SA和ST6GAL1水平的動態(tài)變化

免疫組織化學染色和流式細胞術發(fā)現(xiàn)單個CTC中ST6GAL1水平高于CTC簇，α2,6-SA水平低于原發(fā)腫瘤細胞和肺轉移灶，RNA測序印證了該結果。小鼠尾靜脈注射發(fā)現(xiàn)低α2,6-SA組細胞肺轉移后均變?yōu)榱烁擀?,6-SA播散性腫瘤細胞（DTC）。

六、ST6GAL1的缺失促進TNBC轉移定植

基于多個TNBC PDX腫瘤的聚糖譜鑒定出α2,6-SA高的M1和M3 PDX和α2,6-SA低的M2 PDX（圖4A）。與M1 PDX相比，M2腫瘤細胞生長速度較慢，但形成的簇大5倍（圖4B），自發(fā)肺轉移信號強度高108倍（圖4D）。在上述細胞中擾動ST6GAL1，發(fā)現(xiàn)α2,6-SA水平升高抑制細胞成簇（圖4F）。尾靜脈注射發(fā)現(xiàn)ST6KO細胞播散與肺轉移增加（圖4I），原位移植瘤發(fā)現(xiàn)ST6KO組的腫瘤起始時間延遲、生長較慢，ST6KO M2腫瘤細胞自發(fā)肺轉移更多（圖4L-N），且CTC，尤其是CTC簇更多。

七、ST6GAL1的缺失促進跨內皮遷移性轉移

尾靜脈注射、原位移植瘤發(fā)現(xiàn)低水平的ST6GAL1導致血液CTC簇增加、肺轉移增加和增殖能力降低（圖4N）?？鐑绕みw移試驗發(fā)現(xiàn)ST6KO MDA-MB-231腫瘤細胞遷移效率更高。以上結果表明ST6GAL1具有雙邊調節(jié)作用，即缺乏ST6GAL1減緩腫瘤生長，但促進CTC聚集與肺轉移；ST6GAL1上調促進腫瘤生長，但抑制腫瘤播散轉移。ST6GAL1在CTC中的短暫缺失使CTC的聚集與定植增加，而DTC中ST6GAL1的恢復使定植后腫瘤生長增加。

圖4 在PDX模型中，ST6GAL1抑制簇的形成并阻斷轉移的發(fā)生

八、糖基化蛋白組學揭示ST6GAL1新α2,6-SA化底物

使用接骨木凝集素（SNA）結合MDA-MB-231 ST6WT和ST6KO細胞膜組分或全細胞裂解物中的α2,6-SA化蛋白并進行糖基化蛋白質組學分析（圖5A），共鑒定出217種互作蛋白，其中68個特征性N-糖肽屬于14種糖蛋白（圖5B），IP-WB實驗證明其中PODXL、CD97、ECE1、ALCAM1、ICAM1和CD44與ST6GAL1的相互作用（圖5C）。siRNA敲低發(fā)現(xiàn)下調PODXL、CD97、ECE1和ALCAM1能減少ST6KO腫瘤細胞的成簇，敲低PODXL的效果尤為顯著（圖5D-F）。

與單個CTC相比，CTC簇中PODXL的表達增加（圖5G）。ST6KO細胞中PODXL蛋白水平升高但mRNA表達不變。去唾液酸化的PODXL蛋白（dP）與ST6KO細胞的結合強于其他組合（圖5H）。這表明ST6GAL1介導的PODXL α2,6-唾液酸化可能負調控其穩(wěn)定性和/或抑制腫瘤細胞簇形成所需的蛋白質結合活性。

圖5 糖基化蛋白質組學分析揭示新的ST6GAL1 α2,6-SA化底物

九、靶向PODXL阻斷ST6GAL1缺乏和化療逃避所促進的肺轉移

尾靜脈注射發(fā)現(xiàn)PODXL和ICAM1敲低可有效阻斷腫瘤細胞轉移定植和成簇（圖6A-C），抗PODXL抗體能達成同樣效果（圖6D-I,N）。這表明PODXL作為ST6GAL1新靶點在PAX治療中促進靜止期CTC簇的形成和乳腺癌轉移。

圖6 靶向PODXL阻斷ST6KO或化療引起的轉移

研究結論

在乳腺癌中，由于ST6GAL1及其催化的α2,6-唾液酸化的缺失，CTC簇細胞處于靜止期（G0），轉移、定植及PAX化療逃逸能力增加，導致患者不良預后。糖基化蛋白質組學分析揭示ST6GAL1糖基化底物PODXL有助于CTC成簇和轉移定植。針對PODXL的中和抗體能緩解紫杉醇治療耐藥。