近日，中國(guó)計(jì)量大學(xué)基于肝癌的血清樣本對(duì)比了美國(guó)Thermo Scientific公司的Top14高豐度蛋白去除試劑盒和青蓮百奧血液低豐度蛋白富集試劑盒（DMB）去除血清蛋白質(zhì)組高豐度的效果[1]。結(jié)果表明DMB處理后的蛋白鑒定量在對(duì)照樣本和疾病樣本中分別是Top14的2.6和3.7倍，且DMB處理后低豐度蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋率更高。
圖1：3 種血清蛋白質(zhì)組樣本制備方案的技術(shù)路線[1]
使用DMB、Top14兩種血清樣本前處理試劑盒以及Blank對(duì)照，完成3例健康人和3例肝癌患者的血清蛋白質(zhì)組分析；
DMB處理組鑒定的蛋白質(zhì)組和肽段數(shù)目最高且富集的低豐度蛋白數(shù)量更多；
DMB處理組鑒定的差異蛋白最多；
DMB處理組鑒定的蛋白質(zhì)的GO和KEGG分析結(jié)果遠(yuǎn)比Top14處理組和 Blank組豐富；
DMB處理組篩選出6個(gè)特征蛋白，可作為肝癌篩查候選生物標(biāo)志物。
該研究分別采用了DMB、Top14兩種血清樣本前處理試劑盒以及Blank對(duì)照，完成了3例健康人和3例肝癌患者的血清蛋白質(zhì)組分析。在各樣本中，Top14處理組蛋白質(zhì)和肽段鑒定數(shù)目均高于Blank組，DMB處理組鑒定的蛋白質(zhì)組和肽段數(shù)目最高（圖2a）。在HC中，DMB處理組特征鑒定的蛋白質(zhì)組數(shù)量是 Top14處理組的2.6倍，是Blank組的3.9倍；在HCC中，DMB處理組特征鑒定的蛋白質(zhì)組數(shù)量是Top14處理組的3.7倍，是Blank組的6.2倍。此外，Top14處理組和Blank組鑒定蛋白質(zhì)組的豐度信息相近，DMB處理組鑒定蛋白質(zhì)組的豐度較低（圖2d）。綜合表明，DMB方案在富集血清樣本中的低豐度蛋白質(zhì)效果最佳。
圖2：蛋白質(zhì)和多肽的鑒定情況
該研究分別基于Proteome Discoverer搜庫(kù)和MaxQuant搜庫(kù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)蛋白鑒定穩(wěn)定性和定量穩(wěn)定性。在HC中，DMB處理組鑒定頻率為2的蛋白質(zhì)數(shù)目高于其他兩組，比Top14處理組多鑒定43個(gè)（57.3%），比Blank組多鑒定68個(gè)（136%）；DMB處理組鑒定頻率為3的蛋白質(zhì)數(shù)目同樣高于其他兩組，比Top14處理組多鑒定69個(gè)（25.3%），比Blank組多鑒定143個(gè)（71.9%）（圖3a）。在HCC中，DMB處理組鑒定頻率高的蛋白質(zhì)數(shù)目依然高于其他兩組，增加幅度比在HC中大（圖3b）。但是DMB處理組的穩(wěn)定性相對(duì)較差，這與鑒定頻率為2的蛋白質(zhì)數(shù)目較多有密切關(guān)系（圖3c,d）。
圖3：3種血清樣本前處理方案的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
使用clusterProfile分別對(duì)各組實(shí)驗(yàn)在HC和HCC中特征鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO和KEGG分析。DMB處理組特征鑒定的蛋白質(zhì)的GO和KEGG富集結(jié)果均最豐富，相對(duì)于Top14處理組和Blank組有顯著變化（圖4a），在KEGG富集結(jié)果中表現(xiàn)得最為明顯。DMB處理組特征鑒定的蛋白質(zhì)主要參與的信號(hào)通路有ECM-受體相互作用、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等。
圖4：各方案特征鑒定蛋白質(zhì)的GO和KEGG分析
該研究基于健康人群和肝癌人群的血清樣本，比較了DMB和Top14血液樣本前處理試劑盒相對(duì)于血清原液在蛋白質(zhì)組差異分析中的優(yōu)勢(shì)。Blank組共獲得17 個(gè)差異蛋白，Top14處理組共獲得15個(gè)差異蛋白，DMB處理組共獲得47個(gè)差異蛋白，在肝癌人群中表達(dá)上調(diào)的有41個(gè)，下調(diào)的有6個(gè)（圖5a-e）。差異基因的PCA分析可以很好地區(qū)分健康人群和肝癌人群。3組實(shí)驗(yàn)的差異蛋白質(zhì)組分析均可發(fā)現(xiàn)在肝癌血清樣本中顯著上調(diào)的基因，但在獲得的差異基因數(shù)量上和所行使的功能上有所不同，這對(duì)于理解肝癌的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制有影響。
圖5：Blank、Top14和DMB樣本制備方案肝癌血清樣本差異蛋白質(zhì)組分析
基于上述分析結(jié)果，相較于Blank組和Top14處理組，DMB處理組對(duì)血清中低豐度蛋白的鑒定效果有顯著提升，特征鑒定蛋白的功能富集結(jié)果更加豐富，發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因數(shù)量明顯增多。使用String對(duì)DMB組差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks,PPI）分析。該網(wǎng)絡(luò)圖包含37個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中HSP90AB1、SPP1、ACTR3、SNCA、PECAM1和SRC在健康人群和肝癌人群中表現(xiàn)出顯著差異（圖6b），可作為肝癌篩查候選生物標(biāo)志物。
圖6：基于DMB前處理方案在肝癌血清樣本的差異蛋白質(zhì)組分析
本研究討論了基于Top14和DMB血液樣本前處理試劑盒相對(duì)于血清原液在蛋白質(zhì)組分析中的優(yōu)勢(shì)，以及Top14和DMB2種試劑盒在蛋白質(zhì)組分析中的優(yōu)劣勢(shì)。在肽段和蛋白質(zhì)鑒定方面，DMB處理組蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量遠(yuǎn)高于Top14 處理組和Blank組。DMB處理組對(duì)低豐度蛋白的鑒定有更好的結(jié)果。DMB特征鑒定的蛋白質(zhì)的GO和KEGG分析結(jié)果遠(yuǎn)比Top14處理組和Blank組豐富，證明了DMB處理組鑒定蛋白質(zhì)的多樣性。
參考文獻(xiàn)
[1]趙佳威,陸澳,趙洋等.血清蛋白質(zhì)組高豐度蛋白去除方法比較研究[J/OL].質(zhì)譜學(xué)報(bào):1-12[2024-03-20].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20240318.1717.003.html.
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