準確檢測食品過敏原對加強食品安全管理至關(guān)重要。有效合理的預處理方法可以減少雜質(zhì)的干擾，提高過敏原的提取效率，從而對檢測的靈敏度和準確性起到重要作用。

2024年4月，南昌大學陳紅兵教授團隊在Food Chemistry（IF=8.4）上發(fā)表題目為Lipid matrix-specific pretreatment method for enhancing the extractability and allergenicity maintenance of bovine milk allergens in ELISA detection的研究成果。該研究開發(fā)了一種針對脂質(zhì)基質(zhì)的預處理的方法。然后利用蛋白質(zhì)組學分析確認了預處理對過敏原提取效果的影響。該研究為食品過敏原檢測提供了新策略，強調(diào)了匹配食品基質(zhì)和過敏原類型的預處理方法的重要性。

青蓮百奧為該研究提供蛋白質(zhì)譜檢測和分析服務。

研究思路

1. 根據(jù)成分特性，將食品基質(zhì)進行分類，特別是針對脂質(zhì)基質(zhì)。

2. 結(jié)合超聲輔助正己烷脫脂和弱堿性提取系統(tǒng)，為牛乳過敏原開發(fā)特定的預處理方法。

3. 使用免疫學定量和光譜分析來評估過敏原的提取效率。

4. 通過LC-MS/MS分析、KU812細胞脫顆粒模型和西方印跡法來確認過敏原性是否得到保持。

5. 對準確性（Bias）、重復性（RSDr）、穩(wěn)定性（RSDR）進行評估。

6. 將預處理方法應用于20種商業(yè)食品，并與商業(yè)ELISA試劑盒比較。

7. 使用LCSM（激光共聚焦掃描顯微鏡）和SEM（掃描電子顯微鏡）觀察預處理后脂肪和蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)變化。

8. 測量提取物的粒徑和zeta電位，評估分散系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

研究結(jié)果

一、不同提取方法對牛乳變應原提取性能及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

通過對比12種緩沖液，研究發(fā)現(xiàn)弱堿性緩沖液（如PBS 8.2）更有效地提取牛乳過敏原，且對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞較小。SDS-PAGE分析表明醋酸和檸檬酸緩沖液處理的樣品電泳帶型有顯著差異，不利于蛋白質(zhì)提取和結(jié)構(gòu)維持。CD（圓二色光譜）和內(nèi)源熒光光譜分析顯示弱堿性緩沖液有助于保持蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。ELISA測定發(fā)現(xiàn)PBS 8.2和TBS 8.2在提取主要牛乳過敏原ALA、BLG和CSN方面最有效。據(jù)此，建立了三種優(yōu)化的過敏原預處理方法（ALA-Pre、BLG-Pre和CSN-Pre），顯著提升了提取效率和檢測準確性（圖1）。

圖1 用BLG-Pre和商品試劑盒前處理方法分析不同商品食品中BLG的回收率

二、不同前處理方法的過敏原提取液蛋白質(zhì)組學分析

在蛋白質(zhì)組學分析中，不同預處理方法對牛乳過敏原提取物的蛋白質(zhì)組成和相對含量有顯著影響。ALA-Pre、BLG-Pre和CSN-Pre三種方法分別鑒定出500、470和481種蛋白質(zhì)，其中451種為共同鑒定，而每種方法獨特鑒定的蛋白質(zhì)分別為7、1和4種。層次聚類分析發(fā)現(xiàn)138種顯著差異蛋白，熱圖顯示BLG-Pre形成獨立聚類，ALA-Pre和CSN-Pre形成亞簇，與PCA分析一致。

深入分析七種常見過敏原，包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等，氣泡圖和補充表S3顯示三種預處理方法對特定過敏原提取具有特異性。ALA-Pre、BLG-Pre和CSN-Pre組中豐度最高的過敏原分別為κ-酪蛋白、κ-酪蛋白和αs2-酪蛋白，反映了酪蛋白的高含量和提取效率。特別是αs2-酪蛋白，在CSN-Pre組中的豐度顯著高于其他組。

圖2 過敏原提取物的蛋白質(zhì)組學分析。（A）蛋白質(zhì)數(shù)量，（B）PCA分析，（C）差異蛋白質(zhì)聚類分析，（D）常見牛奶過敏原的相對豐度

三、脂質(zhì)基質(zhì)食品過敏原提取物的過敏原性維持及方法驗證

通過KU812細胞脫顆粒模型評估了不同預處理方法對牛乳過敏原過敏原性的影響。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，所有預處理提取物均能顯著誘導細胞釋放β-己糖苷酶、組胺、IL-4和IL-6，表明過敏原性未受損害。此外，Western blotting分析證實了預處理后的過敏原保持了與對照組相似的IgG結(jié)合能力，沒有顯著變化（圖3）。這些結(jié)果表明，所建立的預處理方法有效保持了牛乳過敏原的免疫反應性和過敏原性。

分析ELISA數(shù)據(jù)后，顯示預處理方法具有出色的準確性（偏差均值分別為-8.47%、-7.94%和-8.90%）。ALA-Pre的重復性和穩(wěn)定性（RSDr為1.52%，RSDR為5.65%），BLG-Pre（RSDr為0.77%，RSDR為3.84%），以及CSN-Pre（RSDr為2.54%，RSDR為6.81%）均在可接受范圍內(nèi)，證明了這些預處理方法在提取牛乳過敏原時的準確性、重復性和穩(wěn)定性。

圖3 使用相應的兔血清對過敏原進行蛋白質(zhì)印跡分析。(A) ALA，(B) BLG，(C) CSN

四、商品試劑盒在實際加工食品中的實際應用比較

在實際食品中的應用測試顯示，與商業(yè)試劑盒相比，新開發(fā)的預處理方法在提取高脂食品中的牛乳過敏原方面更有效，特別是在提取ALA和BLG時，含量顯著高于商業(yè)試劑盒。此外，通過LCSM和SEM成像，新方法在脫脂和過敏原釋放方面表現(xiàn)更優(yōu)，誘導形成了更松散的微結(jié)構(gòu)（圖4）。粒子尺寸和Zeta電位的測量結(jié)果進一步證實了新預處理方法在形成穩(wěn)定分散系統(tǒng)方面的優(yōu)勢，從而提高了過敏原的提取效率和穩(wěn)定性（圖5）。

圖4 LCSM(A)觀察脂質(zhì)分布，掃描電子顯微鏡(B)觀察超微結(jié)構(gòu)。放大倍數(shù)為10k

圖5 過敏原提取物的粒徑(A)和zeta電位(B)

研究結(jié)論

本研究創(chuàng)新性地根據(jù)食品基質(zhì)的組成特性分類，并為脂質(zhì)基質(zhì)中的牛乳過敏原檢測開發(fā)了匹配的預處理方法。研究結(jié)果為食品過敏風險管理提供了科學依據(jù)，并指出了根據(jù)食品基質(zhì)和過敏原類型匹配相應預處理方法的必要性。