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強強聯(lián)合 | 熱蛋白質(zhì)組學+限制性酶解-質(zhì)譜分析揭示滲透劑調(diào)控蛋白聚集機制

瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學院的Paola Picotti團隊,憑借其在限制性酶解-質(zhì)譜分析(LiP-MS)技術(shù)的領(lǐng)先地位,現(xiàn)將視野擴展至熱蛋白質(zhì)組學(TPP)領(lǐng)域。這一跨領(lǐng)域的技術(shù)融合,能夠從結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性雙重視角深入解析滲透劑類藥物的作用機制,為藥物研發(fā)帶來新洞見。


基本情況

iP-MS和TPP是藥物靶點研究領(lǐng)域的核心技術(shù),它們通過監(jiān)測小分子(如藥物分子)與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起的結(jié)構(gòu)或熱穩(wěn)定性變化來鑒定小分子的靶蛋白。傳統(tǒng)上,這兩種技術(shù)是獨立應用的,各自揭示了小分子作用的不同側(cè)面。LiP-MS精細探測小分子引起的蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)變化,揭示藥物分子的潛在結(jié)合位點和構(gòu)象效應。TPP則評估這些變化對蛋白質(zhì)整體熱穩(wěn)定性的影響,反映其對功能的作用。結(jié)合這兩種技術(shù),研究者能全面理解藥物影響靶點穩(wěn)定性的作用機制,為藥物設計和靶點驗證提供深入見解,加速新藥研發(fā)。

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蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定滲透機制的原位分析

2024年8月,瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學院Paola Picotti團隊在期刊Nat Chem Biol(IF=12.9)上發(fā)表了題為“In situ analysis of osmolyte mechanisms of proteome thermal stabilization”的研究論文,該研究創(chuàng)新性地結(jié)合TPP和LiP-MS深入剖析滲透劑在細胞內(nèi)如何調(diào)控蛋白質(zhì)組的熱穩(wěn)定性。研究不僅揭示了滲透劑對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的深遠影響,還闡明了它們在多樣化溫度環(huán)境下對蛋白質(zhì)保護及聚集行為的精細調(diào)控機制,為生物技術(shù)領(lǐng)域和藥物開發(fā)中有效利用這些天然分子開辟了新思路和策略。


滲透機制

滲透機制是細胞適應環(huán)境變化的關(guān)鍵策略之一。滲透劑如甜菜堿和三甲胺-N-氧化物(TMAO)在細胞中積累,幫助細胞適應環(huán)境變化,影響蛋白質(zhì)聚集,對心血管疾病研究至關(guān)重要。體外研究表明滲透物能夠熱穩(wěn)定蛋白,但機制仍有爭議,并在細胞環(huán)境中缺乏系統(tǒng)的研究。LiP-MS可以檢測蛋白質(zhì)的聚集變化,但是LiP-MS數(shù)據(jù)本身無法明確區(qū)分聚集與其它導致蛋白酶敏感性降低的結(jié)構(gòu)變化,因此引入了TPP來監(jiān)測蛋白質(zhì)的熱誘導聚集來評估其熱穩(wěn)定性,從而補充LiP-MS數(shù)據(jù),為研究提供了更全面的視角。


技術(shù)流程

LiP–MS thermal profiling(LiP-MS+TPP)是將蛋白酶K(PK)添加到暴露于溫度梯度的天然裂解物等分液中,PK可切割蛋白的柔性和可接近區(qū)域,隨著溫度的升高,蛋白聚集,越來越少的區(qū)域被PK切割,通過檢測不同溫度梯度下產(chǎn)生的不同肽段豐度,以產(chǎn)生每種蛋白的熱剖面。

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實驗流程


實驗結(jié)果

一、滲透劑對大腸桿菌蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性的影響

作者首先來評估不同滲透劑對大腸桿菌蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性的影響。通過將大腸桿菌裂解液暴露于六種不同的滲透劑(包括TMAO、甜菜堿、甘油、脯氨酸、海藻糖和葡萄糖),觀察到這些化學物質(zhì)如何影響蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。研究結(jié)果顯示,所有測試的滲透劑都能在一定程度上提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。其中,TMAO顯示出最強的穩(wěn)定效果,能夠穩(wěn)定大部分檢測到的蛋白質(zhì)(67.2%),而甘油的穩(wěn)定效果相對較弱。這些發(fā)現(xiàn)為理解滲透劑如何在細胞內(nèi)環(huán)境中保護蛋白質(zhì)免受熱變性提供了新的見解,并可能對開發(fā)新的蛋白質(zhì)穩(wěn)定化策略具有重要意義。

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滲透劑對大腸桿菌蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性的影響


二、滲透劑誘導的蛋白質(zhì)聚集溫度上移來抵抗蛋白沉降

實驗觀察到所有測試滲透劑均促使蛋白質(zhì)聚集的溫度閾值上移,這一現(xiàn)象揭示了滲透劑通過增強蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,有效延遲了蛋白質(zhì)的聚集過程。

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滲透劑誘導的蛋白質(zhì)聚集溫度上移來抵抗蛋白沉降


三、滲透劑通過優(yōu)先排斥機制穩(wěn)定蛋白

該研究利用HEK293T細胞模型,采用LiP–MS thermal profiling深入分析多種滲透劑對人類蛋白質(zhì)組熱穩(wěn)定性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)滲透劑主要通過優(yōu)先排斥機制來穩(wěn)定蛋白質(zhì),即滲透劑與蛋白質(zhì)相互排斥,使得蛋白質(zhì)更傾向于保持其緊密折疊的狀態(tài),從而在細胞內(nèi)環(huán)境中增強了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。此外,還發(fā)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)可能通過與滲透劑的直接結(jié)合來增強熱穩(wěn)定性。

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滲透劑通過優(yōu)先排斥機制穩(wěn)定蛋白


四、TMAO滲透劑的特異性效應

盡管多數(shù)滲透劑對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用具有普遍性,但特定滲透劑如TMAO對有結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)和無序蛋白質(zhì)的影響存在差異,能夠穩(wěn)定球狀蛋白質(zhì)同時促進大型無序蛋白質(zhì)的聚集。

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TMAO滲透劑的特異性效應


實驗結(jié)論

LiP–MS thermal profiling技術(shù)不僅深化了我們對細胞借助滲透劑應對環(huán)境壓力機制的認識,還為探究蛋白質(zhì)在多變環(huán)境條件下的穩(wěn)定性與功能活性提供了強有力的分析平臺。此技術(shù)在藥物研發(fā)領(lǐng)域尤其重要,它有助于篩選和優(yōu)化潛在藥物分子,評估它們對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及聚集行為的作用,進而提升藥物的有效性并降低潛在的副作用風險。


青蓮百奧藥物靶點發(fā)現(xiàn)解決方案

藥物靶點在醫(yī)藥研發(fā)中至關(guān)重要,它們是藥物作用的生物分子,涵蓋蛋白質(zhì)、酶、受體等,對調(diào)節(jié)生物體的生理和病理過程起著決定性作用。藥物靶點的發(fā)現(xiàn)和驗證是新藥研發(fā)的首要步驟,直接關(guān)系到研發(fā)的成敗。青蓮百奧生物科技有限公司專注于臨床需求,以源頭創(chuàng)新為動力,利用其專業(yè)平臺,結(jié)合限制性酶解-質(zhì)譜分析技術(shù)(LiP-MS)和熱蛋白質(zhì)組學(TPP),打造了高效的藥物靶點發(fā)現(xiàn)平臺。這一平臺不僅加速了藥物篩選過程,還提高了藥物的療效和安全性,為個性化醫(yī)療提供了強有力的技術(shù)支持。

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參考文獻:

[1] Pepelnjak M, Velten B, N?pflin N, et al. In situ analysis of osmolyte mechanisms of proteome thermal stabilization [J]. Nature Chemical Biology, 2024, 20(8): 1053-1065.



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