單細胞分辨率的研究使我們能發(fā)現(xiàn)細胞間的細微差異，而不因樣本平均值而丟失有意義的信息。許多技術已用于研究單細胞，基于質譜的單細胞蛋白質組學 (SCP)就是其中之一。近年來，SCP一直在不斷的改進中，細胞通量愈發(fā)提高，所以目前主要問題是當前的技術狀態(tài)是否已準備好用于廣泛生物學研究。
自2023年來，SCP已能實現(xiàn)每個單細胞超過 4,000 種蛋白質檢測通量。目前SCP廣泛應用的主要限制是樣本的細胞通量。與單細胞轉錄組測序相比，SCP文獻的平均捕獲細胞數量少了兩個數量級。但由于蛋白質為是細胞功能的直接載體，且蛋白質與RNA的表達量相關性較低，通過高通量測序技術估算蛋白質豐度并不可靠，因此直接測量單細胞內的蛋白質比RNA更有意義。因此，基于質譜的單細胞蛋白質組學 (MS-based SCP)是未來更關鍵的單細胞技術，有必要評估SCP是否已準備好作為生物學研究的應用工具。
圖1. RNA并不能代表蛋白質的豐度
從基于高通量測序的單細胞轉錄組學文獻來看，他們的共同核心可以簡化為三個基本研究策略：細胞注釋、發(fā)育軌跡和空間映射。2024年7月美國楊百翰大學研究團隊在期刊Journal of Proteome Research發(fā)表文章，以評估單細胞蛋白質組學目前是否已準備好應用于廣泛的生物學研究。本文的主要研究點就在于從這三個研究策略評估SCP的應用水平。
圖2.評估單細胞蛋白質組學應用水平的三個研究策略
假設有一堆由黃豆、綠豆、紅豆組成混合豆子，隨便拿起一顆，通過視覺判斷就知道是哪種豆子，這是通過顏色進行的豆子注釋。類似地，從組織解離得到的單細胞懸液里，也包含各種類型的細胞，而我們可以通過細胞表達的特征基因進行細胞注釋，以將檢測到的每一個細胞都進行分門別類。細胞注釋通常需要數據庫來提供各種細胞的特征基因，比如CellMarker數據庫。SCP可以利用目前已有的數據庫進行細胞注釋，且經過驗證發(fā)現(xiàn)細胞注釋效率和精度高于scRNA-Seq。
圖3.SCP細胞注釋更細致和準確
為了給下游分析提供有意義的注釋，SCP需要足夠的細胞通量和蛋白組學深度。但具體是多少呢？作者概括了在分析時必須考慮的幾個因素：
捕獲的細胞數量；
每個細胞的蛋白檢測深度；
批次效應；
Double-Dipping數據重復使用。
SCP分析需要的細胞數量取決于許多參數（所需細胞類型的預期稀有性/濃度、預期樣本脫落/存活率等），作者以白細胞主要亞型為例，演示如何估算需要采樣的細胞數量：假如在一份樣本中細胞占比為中性粒細胞（62%）、淋巴細胞（30%）、單核細胞（5.3%）、嗜酸性粒細胞（2.3%）和嗜堿性粒細胞（0.4%），為了確保最稀有的嗜堿性粒細胞能被注釋到，設定需要至少5個細胞被捕獲。假設從樣本中隨機抽取細胞，則需要 3,274 個細胞才能有99%的概率成功對最稀有的細胞類型進行至少 5 次采樣，考慮到細胞質控的過濾規(guī)則，設定1%為損耗，則至少需要3,308 個細胞被捕獲。因此，細胞通量是 SCP 中細胞注釋的一大難點。
注：n表示細胞總數，x表示成功次數，k表示所需的最小成功次數，p表示成功事件的概率，P表示總體概率
注：n表示細胞數量，d表示細胞質控損失率，nadj表示需要采集的質控過濾后細胞數量
細胞注釋所需的蛋白質組學深度并不容易計算，這取決于目的細胞類型以及特征蛋白的豐度。目前，SCP通常檢測到細胞內較豐富的蛋白，因為在實際情況中被測蛋白是隨機采樣的。隨著深度的增加，SCP文獻中報道了更多中低豐度蛋白。從細胞注釋原理來說，絕大部分情況是基于單個蛋白陽性或陰性進行的，比如CD4+T細胞，CD4蛋白分子的豐度已經足夠區(qū)分這個亞群。但少數的細胞類型依靠低豐度蛋白進行注釋，原因是一方面這些細胞占比可能很低，另一方面可能是蛋白本身表達較低但亞群特異性高。而在公開的數據中，已經證實了基于蛋白表達的細胞注釋遠比基于RNA的注釋更準確，更能注釋稀有細胞亞群。而目前SCP 覆蓋的深度（4000+蛋白質）與 scRNA-Seq的覆蓋深度相當甚至超過，具體取決于技術平臺、細胞類型等。
許多基礎分析如細胞注釋的前提是假設豐度值可以在樣本間進行比較。批次效應是一種技術噪聲，它會導致蛋白豐度產生偏移，令數據無法在樣本之間直接比較。在 SCP 中，批次效應也是阻礙分析進度的一座大山，但質譜檢測有一個好處，在實驗條件不變的情況下，可以使用內標或外標校準樣品之間的蛋白豐度值。這是scRNA-Seq無法做到的一點。
生物體從胚胎時期一個受精卵開始發(fā)育，細胞經過不斷分裂壯大數量，經過不斷分化各司其職。比如免疫學上的T細胞包括CD4+T細胞、CD8+T細胞等，這些T細胞均由幼稚T細胞分化發(fā)育而來。在單細胞層面看來，生物體內正在發(fā)育的細胞可以觀察到中間分化階段的連續(xù)分布，比如從幼稚T細胞→幼稚CD4+T細胞→Treg細胞，這稱為發(fā)育軌跡。根據定義，細胞注釋不允許漸進的連續(xù)細胞分布，所以通過單細胞軌跡分析得到細胞發(fā)育路徑，也是SCP的重要分析之一。
軌跡分析是單細胞水平的特色分析手段。在scRNA-Seq中，常用的分析工具包括monocle2、GeneSwitch、PAGA等，核心原理都是通過一些特征基因表達模式的改變判斷細胞在分化路徑上的位置。然而，轉錄層面的改變并不完全代表蛋白豐度的變化，特別是在單細胞水平。所以，在SCP中進行軌跡分析顯得尤為重要。
將軌跡分析用于SCP，需要足夠的細胞通量與合適的分析工具。下面概述了在發(fā)育軌跡推斷分析中 SCP 數據的三個重要考慮因素：
捕獲的細胞數量；
SCP 軌跡推斷工具的可用性；
Double-Dipping數據重復使用。
如果軌跡的所有階段同時出現(xiàn)在一個樣本中（例如，骨髓樣本中的造血細胞發(fā)育），那么對樣本中的細胞進行充分采樣可以捕捉到所有的細胞發(fā)育狀態(tài)，這里的“充分”就是關鍵。所需的確切細胞數量取決于三個因素，構建軌跡的復雜性、過渡狀態(tài)的數量以及細胞在每個狀態(tài)下所花的時間。采樣策略必須考慮在發(fā)育的單個時刻、軌跡上以及生物重復之間捕捉細胞多樣性的方法。由于目前 SCP 的細胞通量較為有限，因此在實驗設計中需要在每條軌跡的細胞數量和軌跡的重復數量之間進行權衡（如下圖）。重復的軌跡可以幫助我們確定軌跡的推斷結構，以及軌跡在多個樣本間是否成立，但細胞數量少可能導致軌跡準確度下降。為此，Boekweg 等人開發(fā)了一個基于軌跡的功效分析框架，并模擬了實驗中的真正陽性和假陽性發(fā)現(xiàn)率（DOI: 10.1016/j.mcpro.2021.100085）。
圖 4. 在發(fā)育軌跡實驗中平衡每次重復的細胞數量和重復次數。例如可以制作一個 200 個細胞的軌跡 (a)，或者可以制作四個 50 個細胞的軌跡 (b)。
目前常用的軌跡分析軟件是為scRNA-Seq開發(fā)的，可以適用于其他類型包括SCP的數據。但也有例外——RNA velocity——通過分析未剪接和剪接RNA的比例獲取細胞發(fā)育軌跡，常見的蛋白質組學流程不會模擬“未成熟”的蛋白質。
空間映射是在組織的空間層面進行原位分子檢測。最早的空間映射方法是免疫染色法，使用染色劑對組織切片進行分子標記，再通過顯微鏡觀察被標記的程度和位置。但這樣的方法檢測通量很低，且會受到分子特異性的影響。隨著 MALDI-MS 、 LCM-MS 等技術的出現(xiàn)，細胞內的無偏分子測量應運而生，通過獲取組織“像素級”的質譜圖并對整個樣本進行分析。
目前，空間蛋白質組學采用兩種常見的實驗設計：MALDI 和LCM激光捕獲顯微切割。這兩種技術都需要權衡數據采集速度和蛋白檢測深度。
圖5. 兩種蛋白質組學空間映射技術的功能比較
MALDI 在質譜成像方面有著悠久的歷史，在原位進行樣本局部破壞以快速的質譜檢測，原理決定了這項技術在高空間分辨率下使用時靈敏度會較低，且難以獲取大量離子的 MS2 信息，導致蛋白檢測深度較低。激光捕獲顯微切割與質譜聯(lián)用（LCM-MS）使用激光從樣本中手動切割出單個目標區(qū)域，再進行單獨的蛋白質組學檢測。LCM-MS可以切割任何感興趣的區(qū)域，包括單個細胞的精確邊界或亞細胞位置，且由于是單獨進行的質譜檢測，LCM-MS的蛋白檢測深度很高，可以對樣品進行深入探究。
類比scRNA-Seq與空間轉錄組學，SCP也可以對空間蛋白質組學結果進行空間映射，以提高空間分群的準確性。但同時也存在兩個重要考慮因素：
樣本的分辨率；
樣本數量。
在對組織切片進行空間分析時，空間分辨率很重要。LCM可以切出單個細胞或者剪切出任意形狀和大小的較大區(qū)域，區(qū)域越大，包含的肽越多，質譜信號就越強。例如1個細胞和 10 個細胞，或一個神經元和一個上皮細胞，識別的肽段數量差很多。但區(qū)域越大，分辨率越低，顯然也是需要衡量的一個因素。
在 SCP 中，獲取的樣本數量也是一個重要的參數。在空間轉錄組學中，市售平臺具有標準化的空間分辨率和幾何形狀，例如 10X Visium 平臺每張載玻片包含 5,000 個Spot。然而，在空間蛋白質組學中，商業(yè)平臺較少，實驗設計以適合研究目的為主要，具有較大的自由度。青蓮百奧可以為您提供全流程一站式的空間蛋白組學服務，從樣品準備到目標區(qū)域選取，從蛋白檢測到數據分析，提供個性化解決方案，可接受OCT包埋或FFPE樣本。而且國內首篇空間蛋白組學文章——SCP構建人類皮膚的細胞空間圖譜（北京協(xié)和醫(yī)學院，DOI: 10.1038/s41467-022-31659-9）——由青蓮百奧提供空間蛋白組學服務。
過去十年，單細胞技術蓬勃發(fā)展，各種方法可以越來越詳細地表征 DNA、RNA 和蛋白質。基于質譜的單細胞蛋白質組學在生物學研究中具有巨大潛力。上述三種研究策略（細胞注釋、發(fā)育軌跡和空間映射）均涉及權衡問題，除非 SCP 的細胞通量能大幅提高。在細胞注釋中，包括所需捕獲的細胞數量，以及如何設置實驗以使批次效應不會掩蓋本身的差異。在發(fā)育軌跡中，包括構建軌跡需要的細胞數量，以及生物學重復的數量。在空間映射中，包括在樣本分辨率和所需樣本數量之間進行權衡。
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