在熱蛋白質(zhì)組分析（TPP）中，數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）結(jié)合TMT標記技術(shù)，通過多路復(fù)用樣本提高了定量精度。但隨著數(shù)據(jù)獨立采集（DIA）技術(shù)的發(fā)展，它以更高的靈敏度和更全面的蛋白質(zhì)覆蓋率，以及降低的成本和簡化的樣品制備流程，對TMT-DDA的TPP分析方法提出了有力的挑戰(zhàn)，特別是在需要大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究的場合。。

2023年英國紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)Maria Emilia Due?as教授在期刊J Proteome Res（IF=3.8）上發(fā)表了題為“Comparison of Quantitative Mass Spectrometric Methods for Drug Target Identification by Thermal Proteome Profiling”的研究論文，該研究比較了TPP中的兩種定量方法--TMT-DD和DIA的表現(xiàn)，指出在TPP實驗方法時應(yīng)考慮實驗周期、成本、定量精度、靶點全面性等因素，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量和分析準確性。

研究思路

• 樣本：急性髓系白血病（AML）的THP-1細胞系。

• 分組：藥物處理組（用losmapimod處理）和對照組（DMSO處理）。

• 數(shù)目：8個不同的溫度點（40℃, 44℃,48℃, 52℃, 56℃, 60℃, 64℃, and 68℃）進行。

• 重復(fù)：三次生物學(xué)重復(fù)。

• 數(shù)據(jù)處理：五組，分別為：TMT-DDA組、Direct DIA組、DDA library組、Hybrid library組和DIA-NN組（Library free組）。

TPP不同方法比較實驗流程

研究結(jié)果

對于實驗人員而言，時間就是效率。在對TMT-DDA與DIA方法的全面比較中，我們發(fā)現(xiàn)TMT-DDA以其快速的樣品準備和高效的數(shù)據(jù)分析，脫穎而出成為用時最短的方法。這對于追求實驗速度和效率的科研工作者來說，無疑是個令人欣慰的選擇。

TMT-DDA方法的樣品準備時間大約是24小時，但質(zhì)譜分析時間是75小時，使得總體時間相對較短。DIA方法的樣品準備時間大約是8小時，但質(zhì)譜分析時間需要96小時（涉及每個樣品的單次上機（single-shot）分析），因此總體時間較長。

TPP不同方法用時比較

整體蛋白檢測深度不分上下

其次關(guān)心的就是蛋白的鑒定深度了，若改變方法導(dǎo)致蛋白鑒定數(shù)目大幅下降，那無疑是得不償失了。通過對不同方法的蛋白以及肽段鑒定數(shù)目的比較，發(fā)現(xiàn)DIA-NN在蛋白質(zhì)鑒定深度上表現(xiàn)出色。雖然DDA與DIA的檢測方法差別較大，但是所有方法之間發(fā)現(xiàn)了已鑒定蛋白質(zhì)組的相當(dāng)大的重疊，與之前的研究一致， DIA方法和TMT-DDA之間平均67%的蛋白質(zhì)組是共有的。

TPP不同方法蛋白鑒定深度比較

熱熔曲線擬合不分上下

在熱蛋白組分析（TPP）中，蛋白鑒定數(shù)目是評估分析方法性能的一個關(guān)鍵指標，但并非唯一標準。研究指出，DIA-NN在低溫條件下鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目更多，而TMT-DDA在高溫條件下表現(xiàn)更佳，而高低溫的數(shù)據(jù)對于生成可靠的熔解曲線至關(guān)重要。在擬合熱熔曲線時，只有滿足R2≥0.8和平臺值≤0.3的曲線才被納入分析，以確保蛋白質(zhì)熔點計算的準確性。TMT-DDA平均量化了4497個蛋白的曲線，而DIA-NN生成了4458條曲線，略少于TMT-DDA。此外在選擇分析方法時需考慮實驗設(shè)計和目標蛋白熔點的特性，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量和分析準確性。

TPP不同方法蛋白擬合曲線比較

TMT的壓縮效應(yīng)

在TPP分析中，TMT標記可能會影響測量敏感度。研究以藥物losmapimod的已知靶標MAPK14為例，發(fā)現(xiàn)DIA成功實現(xiàn)了從對照組的44.6 ± 0.1°C到實驗組的50.0 ± 0.3°C的精確溫度變化測量。相比之下，TMT-DDA方法測得的MAPK14的熔解溫度比DIA平均高出0.9°C，這可能源于前體離子共分離導(dǎo)致的定量準確性降低，比率壓縮造成的熱位移測量不足，DIA方法顯示出對熱穩(wěn)定性微小變化的高敏感性。 

藥物靶點MAPK14在不同檢測方法中的表現(xiàn)

TMT-DDA熱位移定量精度更佳

在評估熔解曲線的蛋白質(zhì)的熱位移時，研究觀察到LFQ-DIA相較于TMT-DDA產(chǎn)生了略高的平均熱位移（0.6 ± 1 °C對比-0.2 ± 1 °C），暗示了LFQ-DIA在定量上的微弱不精確性。此外，在較高溫度下，LFQ-DIA在熔點測定的精度上不如TMT-DDA。DIA方法在蛋白質(zhì)組成一致的樣本中最為準確，因為它依賴于可比的肽段剖面進行無標記定量。在較低溫度時，由于蛋白質(zhì)熔解較少，DIA能提供可靠的定量結(jié)果。但在較高溫度下，許多蛋白質(zhì)可能已經(jīng)達到其熔點，此時LFQ-DIA的定量準確性可能降低。因此，在涉及較高溫度范圍的實驗設(shè)計中，TMT-DDA因其在準確性和可靠性上的輕微優(yōu)勢，應(yīng)被考慮作為首選方法。

TMT-DDA熱位移定量精度更佳

TMT-DDA鑒定靶點更全面

在分析不同質(zhì)譜方法篩選藥物靶點的能力時，研究發(fā)現(xiàn)TMT-DDA技術(shù)能夠鑒定出DIA方法未能檢測到的2個靶點。其中一個蛋白靶點的熱穩(wěn)定性增加，而在DIA數(shù)據(jù)中并未被捕捉到，這提醒后續(xù)研究在方法選擇上需謹慎。此外，TMT-DDA還鑒定出另一個靶點，其在DIA數(shù)據(jù)中因生物重復(fù)間的高變異性而被濾除，這暗示TMT-DDA在處理噪聲方面可能具有更高的容忍度。這些發(fā)現(xiàn)突顯了在藥物靶點鑒定中，不同質(zhì)譜采集技術(shù)各有優(yōu)勢，同時也揭示了它們在數(shù)據(jù)解析上的特定局限性。

總結(jié)

在評估TPP實驗的檢測方法時，盡管TMT-DDA和DIA在蛋白鑒定和曲線擬合上各有所長，但TMT-DDA以其快速的實驗周期和在高溫區(qū)域的高定量精度而更具優(yōu)勢，在熱位移定量精度上略勝一籌。然而，也需注意TMT標記可能導(dǎo)致的壓縮效應(yīng)，這可能會影響Tm值的準確測量。因此，選擇最佳方法時，應(yīng)綜合成本、實驗效率、定量準確性和靶點鑒定的全面性做出選擇~

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參考文獻

[1] Savitski M M, Reinhard F B M, Franken H, et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome [J]. Science, 2014, 346(6205).
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