玉兔搗藥是中國神話傳說故事之一。見于漢樂府《董逃行》。相傳月亮之中有一只兔子，渾身潔白如玉，所以稱作"玉兔"。這種白兔拿著玉杵，跪地搗藥，成蛤蟆丸，服用此等藥丸可以長生成仙。久而久之，玉兔便成為月亮的代名詞。

舉頭望明月，低頭做仙方。找到藥靶很重要，實驗細節(jié)很考究。實驗濃度與時間選擇合適才能快速找到藥靶，求得仙方。怎么拿捏這一重要環(huán)節(jié)，求得“煉丹術”呢？往下看：

一、查看藥物說明書

這是獲取藥物使用濃度和孵育時間的直接來源。一般來說，商品化的藥物說明書上都會標注藥物的貯存濃度、使用濃度以及孵育時間，我們拿到之后應該先看一下廠家怎么說~以脂多糖（LPS）刺激免疫細胞為例，我們查閱說明書可以看到孵育濃度為2 μg/mL，孵育時間為1~3天?？梢栽诖嘶A上做加減法進行實驗找到適合自己的實驗條件~

脂多糖（LPS）刺激免疫細胞（數(shù)據(jù)來源脂多糖（LPS）刺激免疫細胞-流式實驗-賽默飛 | Thermo Fisher Scientific - CN）

二、檢索相關文獻

當說明書的信息不足以滿足特定樣本類型的需要時，可以通過文獻檢索來找到其他研究者在類似實驗條件下使用的藥物濃度和孵育時間。以Pumbed為例，輸入藥物及樣本類型，選擇相關的文章看看前輩們都是怎么做的，以LPS為例，我們輸入“l(fā)ps incubation”和“RAW264.7”，查閱檢索到的文章，篩選適合自己的方案?？梢栽跈z索匯總的結果的基礎上做加減法進行實驗找到適合自己的實驗條件~

Pumbed文獻檢索

三、藥物劑量和時間梯度預實驗

藥物劑量選擇

在缺乏文獻指導時，通過預實驗來確定藥物的最佳濃度是一種實用的方法。首先進行廣泛的濃度梯度實驗，以識別藥物活性的大致范圍。然后，根據(jù)初次結果，選擇一個更窄的濃度區(qū)間進行更精細的測試，以縮小最佳濃度范圍。

這其中有兩個關鍵衡量指標，那就是半最大抑制濃度（IC50）和半最大效應濃度（EC50），IC50值是指在藥物濃度-反應曲線上能夠抑制50%細胞活性的濃度；EC50是激活50%靶標活性所需的濃度，這是常用的衡量藥物活性的參數(shù)。IC50值和EC50值可以作為初始參考濃度，但需根據(jù)實驗目的和細胞類型進行優(yōu)化。

在設計藥物濃度梯度時，推薦選擇6至10個濃度點，包括0濃度對照。這些點應等比分布（2,3,4,5,10等），如以2為基數(shù)，則濃度可設為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6等，系統(tǒng)檢測細胞的活力，來探索藥物效果隨劑量變化的關系。

藥物劑量梯度預實驗

藥物濃度效應曲線通常呈現(xiàn)S型或反S型，且在IC50/EC50附近變化最為顯著，類似指數(shù)增長，因此IC50/EC50的計算通常采用對數(shù)轉換。此外，IC50/EC50值可能因細胞狀態(tài)不同而波動，有時變化幅度可達2-5倍，這是實驗中常見的現(xiàn)象。

以本圖為例，從圖中可以看到此藥物的IC50為30μg/mL，后續(xù)可以以此濃度進行后續(xù)實驗。

AS-IV的IC50 實驗^[1]

藥物時間選擇

在藥物研究中，孵育時間的選擇至關重要，它影響藥物的最終效果。

首先應根據(jù)藥物的作用機制和實驗需求進行作用時間的選擇，短期作用時間通常為幾分鐘至幾小時，而長期作用時間可達數(shù)天。選擇合適的作用時間能有效評估藥物對細胞生長、凋亡及信號通路的影響。

明確藥物作用機制、實驗需求以及藥物濃度后，設計不同時間點的實驗（如0.5小時、1小時、2小時、6小時、24小時等）可以揭示藥物效應的時間依賴性（類似藥物劑量選擇）。

根據(jù)數(shù)據(jù)繪制藥物效應隨時間變化的曲線，幫助識別藥物的峰值效應時間，進而確定最佳作用時間。

評估藥物效應

在藥物作用評估中，可以通過以下實驗獲取關鍵數(shù)據(jù)：

1、細胞實驗：

• 細胞活力檢測：MTT和CCK-8等方法用于評估藥物對細胞生長的影響，確保藥物濃度在有效范圍內(nèi)，避免非特異性細胞死亡。

• 蛋白和基因表達分析：使用Western Blot、ELISA和qPCR等技術檢測特定靶標的表達，了解藥物對目標通路的影響。

• 實時監(jiān)測：熒光標記和活細胞成像可用于實時觀察藥物對細胞內(nèi)結構和功能的影響。

2、動物實驗：

• 血藥濃度和藥代動力學：測定血藥濃度，結合藥代動力學（PK）和藥效動力學（PD）來優(yōu)化藥物劑量和作用時間。

• 采樣時間點設計：根據(jù)藥物半衰期和分布動態(tài)選擇適當?shù)牟蓸訒r間點（如給藥后1小時、6小時、24小時等），以確定最佳劑量和作用時間。

這些方法和設計有助于全面評估藥物的效果和優(yōu)化使用條件。

毒性評估

在確定藥物的作用濃度及時間后也要觀察藥物是否對細胞產(chǎn)生了不必要的毒性，可以采用下面方法進行探究~

• 細胞毒性實驗：在確定藥物有效濃度和作用時間的同時，使用MTT、CCK-8、LDH釋放等方法評估藥物的細胞毒性，確保藥物濃度不引起過多非特異性傷害。

• 凋亡和壞死檢測：通過流式細胞術、Annexin V/PI染色等方法檢測細胞凋亡和壞死，評估藥物是否引發(fā)不希望的細胞死亡。

小編的分享就到這里啦~希望對您的科研有幫助！藥物預實驗不要急，慢慢來，實驗最需要的就是靜心和耐心~

【參考文獻】

[1] Li D, Li G, Chen Y, et al. Astragaloside IV protects ATDC5 cells from lipopolysaccharide-caused damage through regulating miR-203/MyD88 [J]. Pharmaceutical Biology, 2020, 58(1): 89-97.