蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了重要蛋白好開心，但找不到合適驗證抗體好沮喪？這時候靶向蛋白質(zhì)組PRM閃亮登場！
不需要抗體；
高通量：單次可驗證超過50種以上蛋白；
高靈敏度：翻譯后修飾也適用；
無物種限制。
下面我們來看看PRM到底是什么？以及它適用的場景吧！
根據(jù)是否對目標(biāo)蛋白進行定量，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)可分為非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)。靶向蛋白組學(xué)定量主要包括MRM（multi reaction monitoring, 多反應(yīng)監(jiān)測）/SRM（selective reaction monitoring，選擇反應(yīng)監(jiān)測）和PRM (parallel reaction monitoring, 平行反應(yīng)監(jiān)測）。
圖1：基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分類
MRM技術(shù)基于三重四極桿質(zhì)譜儀，一次掃描只獲得一個子離子的信號。根據(jù)理論肽段母離子m/z和碎片離子m/z，選擇特異性的母-子離子對（Transition），使得在四級桿（Q1）只篩選指定的母離子通過，進入到Q2碰撞室進行母離子碎裂，然后Q3只篩選指定的碎片離子通過，從而實現(xiàn)篩選（圖2上）。
PRM是MRM的衍生技術(shù)，技術(shù)借助Q-Orbitrap為代表的四極桿-高分辨質(zhì)譜平臺進行數(shù)據(jù)采集，一次掃描獲得該目標(biāo)離子的所有子離子信號。四級桿（Q1）選出的目標(biāo)肽段離子，進入碰撞室中打碎，所有的碎片離子經(jīng)過質(zhì)量分析器產(chǎn)生完整的二級質(zhì)譜分析，后期可以通過高分辨一級數(shù)據(jù)或者提取其中的碎片離子信息實現(xiàn)目標(biāo)肽段的定量（圖2下）。
圖2：MRM/SRM和PRM的工作原理[1]
PRM常被稱為“質(zhì)譜領(lǐng)域的WB”，相較于WB，PRM不需要抗體，通量高，一次可以鑒定超過50個蛋白，還可以靶向檢測翻譯后修飾的蛋白。
相較于傳統(tǒng)SRM，PRM的優(yōu)勢是單針方法中增加靶向肽段數(shù)量、譜圖具有高度專一性、靈敏度更佳，重現(xiàn)性更好，在復(fù)雜背景中的抗干擾能力更強。在實際操作方面，PRM比SRM更簡單，成本更低，主要表現(xiàn)在：
不需要預(yù)先設(shè)計靶向蛋白質(zhì)的母離子/子離子配對信息，節(jié)約實驗設(shè)計和操作時間；
獲得的二級質(zhì)譜信息還可以可靠定性，排除同時間流出物的干擾。
PRM在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，但也有很多應(yīng)用問題被提出，小編為大家摘錄如下，方便大家更好的應(yīng)用這項定量技術(shù)：
圖3：PRM相對定量/絕對定量的技術(shù)流程
問題一：PRM相對定量和絕對定量的應(yīng)用場景分別是什么？
PRM通過加入內(nèi)標(biāo)肽實現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對定量和絕對定量。相對定量適用于差異蛋白在不同組別間差異的比較確認(rèn)。絕對定量中，適用于需要精確獲取蛋白質(zhì)絕對濃度的情況，例如生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量檢測和藥物代謝動力學(xué)研究等。
在標(biāo)志物的研究過程中，從發(fā)現(xiàn)到驗證階段，蛋白標(biāo)志物的范圍和數(shù)量逐漸縮小，PRM的相對定量和絕對定量在不同的階段發(fā)揮作用。
在標(biāo)志物篩選的早期階段，通常使用非靶向的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來鑒定差異表達的蛋白質(zhì)，篩選出大量候選標(biāo)志物。PRM技術(shù)的相對定量可以用來過濾發(fā)現(xiàn)期差異蛋白質(zhì)，初步驗證（Verification）這些蛋白質(zhì)在不同樣本（如疾病和正常樣本）中的差異表達。
標(biāo)志物篩選的后期通過PRM在更大規(guī)模和不同臨床研究中心的樣品中進行定量檢測，減小儀器和臨床樣品背景干擾帶來的分析影響。在這個階段通過加入重標(biāo)肽實現(xiàn)絕對定量，精準(zhǔn)計算出目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對濃度，用于后續(xù)臨床診斷試劑盒開發(fā)和藥物開發(fā)。
圖4：PRM應(yīng)用于生物標(biāo)志物驗證
問題二：如何挑選PRM肽段？
肽段的特異性：優(yōu)先選擇蛋白質(zhì)唯一鑒定肽段（Unique peptides），保證定量的高度特異性，避免具有相似序列蛋白質(zhì)的定量干擾。
肽段的強度：考慮那些在DDA（Data-Dependent Acquisition）實驗中得分高且強度高的肽段。提高該肽段在多個樣本中的檢出率。
肽段的修飾：如果研究的目的是檢測特定類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（如磷酸化、乙?；龋瑒t需要選擇包含修飾位點的肽段。否則避免選擇修飾肽段（例如甲硫氨酸氧化肽段等）影響蛋白質(zhì)定量結(jié)果。
肽段的漏切位點：排除含有漏切位點（KR）的肽段，以及末端為連續(xù)KR的肽段。避免蛋白序列因為漏切出現(xiàn)的冗余定量。
問題三：PRM的結(jié)果和Western blot/ ELISA的結(jié)果不一致是怎么回事？
PRM和Western blot/ ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是不同的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，它們在原理、操作和應(yīng)用上有所差異，這些差異可能導(dǎo)致它們的結(jié)果不一致。Western blot/ELISA是一種基于免疫反應(yīng)的定量方法，依賴于特異性抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)抗原特異性結(jié)合，來進行定量分析。盡管操作簡單易行，但受限于抗體對目標(biāo)蛋白序列的特異識別區(qū)域。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)具有相似序列時，ELISA常不能進行特異性區(qū)分，例如對于蛋白質(zhì)截短體和翻譯后修飾形式。但PRM通過特異性選擇蛋白質(zhì)的序列，精準(zhǔn)的獲得蛋白質(zhì)的定量結(jié)果，因此定量結(jié)果和ELISA可能會有不一致的呈現(xiàn)。
研究工作中涉及到蛋白或多肽的靶向定量均可以通過PRM技術(shù)來實現(xiàn)，因此在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用非常廣泛。
神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體已被確定為篩選阿爾茨海默?。ˋD）生物標(biāo)志物的最佳來源。然而，很少有研究關(guān)注從AD血漿中分離出的大量外泌體群體。該研究對血漿外泌體中的328種蛋白質(zhì)進行了定量,31種蛋白質(zhì)在AD患者中發(fā)生了改變，使用PRM驗證了其中12種差異蛋白?；诖碎_發(fā)了邏輯模型，確定六種蛋白組合的診斷能力，表明血漿外泌體的蛋白質(zhì)組分析可能有助于AD診斷。
北京青蓮百奧生物科技有限公司是一家專注于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測和分析的創(chuàng)新性平臺企業(yè)，公司以臨床需求為導(dǎo)向、以源頭創(chuàng)新為核心驅(qū)動力，為蛋白質(zhì)組檢測以及蛋白質(zhì)診療標(biāo)志物的臨床轉(zhuǎn)化提供一站式的完整解決方案。公司圍繞血液、外泌體、組織切片、單細(xì)胞等領(lǐng)域，成功打造新一代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生信平臺，平臺具有全自動、微量檢測、高深度覆蓋、定量準(zhǔn)確等特點，為蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床應(yīng)用提供切實、落地的解決方案。
【參考文獻】
[1] Sweredoski MJ, Moradian A, Hess S. High-Resolution Parallel Reaction Monitoring with Electron Transfer Dissociation for Middle-Down Proteomics: An Application to Study the Quantitative Changes Induced by Histone Modifying Enzyme Inhibitors and Activators. Methods Mol Biol. 2017;1647:61-69. doi:10.1007/978-1-4939-7201-2_4
[2] Cai H, Pang Y, Wang Q, et al. Proteomic profiling of circulating plasma exosomes reveals novel biomarkers of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2022;14(1):181. Published 2022 Dec 5. doi:10.1186/s13195-022-01133-1
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