癌癥一直是人類健康的主要威脅之一。在眾多癌癥驅(qū)動(dòng)的基因中，KRAS的地位尤為突出。KRAS基因突變與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，特別是在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）中。KRAS通過激活RAF-MEK-ERK信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，但ERK（細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）的具體作用尚不完全清楚。最近，一項(xiàng)突破性研究為我們理解KRAS在癌癥種的作用提供了新的視角。

2024年6月7日，北卡羅來納大學(xué)教堂山分校的Channing J. Der研究團(tuán)隊(duì)和Clint A. Stalnecker團(tuán)隊(duì)，在《Science》（IF=44.7）上發(fā)表了題目為“Determining the ERK-regulated phosphoproteome driving KRAS-mutant cancer”一項(xiàng)突破性研究，通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)性地鑒定ERK在KRAS突變型癌癥中的磷酸化底物，以揭示ERK如何支持腫瘤生長(zhǎng)。

研究思路

• MIB-MS：用ERK抑制劑處理1或24 h的6個(gè)KRAS突變細(xì)胞系，每組3重復(fù)；

• 磷酸化蛋白質(zhì)組：用ERK抑制劑處理1或24h的6個(gè)KRAS突變細(xì)胞系，每組4重復(fù)；

• 突變體構(gòu)建+功能實(shí)驗(yàn)+轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)ERK對(duì)KRAS突變胰導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)錄本的影響；

• 磷酸化蛋白質(zhì)組+蛋白質(zhì)組+生物信息學(xué)分析與激酶網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建評(píng)估ERK抑制劑引起的磷酸化網(wǎng)絡(luò)變化。

結(jié)果速遞

一、ERK1和ERK2支持KRAS依賴性生長(zhǎng)

本研究主要探討了MEK1和ERK2在KRAS突變型PDAC細(xì)胞中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，激活的MEK1而非AKT1，導(dǎo)致PDAC細(xì)胞對(duì)靶向突變KRAS藥物產(chǎn)生抗性。ERK在癌癥中通常沒有激活突變，可能是因?yàn)閱吸c(diǎn)突變不足以完全激活ERK，使其作為較弱的致癌基因。通過在KRASG12D突變型PDAC細(xì)胞系中表達(dá)持續(xù)激活的ERK1和ERK2變異體，發(fā)現(xiàn)這些變異體能夠顯著誘導(dǎo)ERK底物FRA1的磷酸化，并且使細(xì)胞對(duì)MEK1/2抑制劑產(chǎn)生抗性，但對(duì)ERK1/2選擇性抑制劑SCH772984保持敏感。此外，通過siRNA介導(dǎo)的ERK1或ERK2急性抑制研究，發(fā)現(xiàn)ERK1和ERK2在促進(jìn)KRAS依賴的PDAC生長(zhǎng)中功能冗余，而非具有獨(dú)特功能。這些發(fā)現(xiàn)支持了ERK1和ERK2在維持腫瘤生長(zhǎng)中的冗余信號(hào)輸出。

圖1：ERK信號(hào)對(duì)于KRAS調(diào)控的PDAC生長(zhǎng)至關(guān)重要

二、KRAS突變體PDAC中ERK依賴性磷酸化蛋白組

使用選擇性ERK抑制劑SCH772984對(duì)6株KRAS突變的PDAC細(xì)胞系進(jìn)行了1h和24h處理，并進(jìn)行了多重激酶抑制珠質(zhì)譜（MIB-MS）和LC-MS/MS磷酸化蛋白組學(xué)分析。結(jié)果顯示，共檢測(cè)到13646個(gè)不同的磷酸化位點(diǎn)，其中932個(gè)和4288個(gè)分別在1h和24h時(shí)差異調(diào)節(jié)。與現(xiàn)有的ERK底物匯編相比，本研究中的PDAC ERK依賴性磷酸化位點(diǎn)和蛋白質(zhì)重疊度較低。此外，與臨床PDAC患者的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)相比，本研究結(jié)果表現(xiàn)出更高的一致性，并在不同癌癥類型和物種中驗(yàn)證了其普遍性和可靠性。

圖2：KRAS突變體PDAC中ERK調(diào)控的磷蛋白組學(xué)

三、ERK調(diào)控富含ERK相關(guān)作用基序的磷酸化蛋白組

通過免疫熒光染色和ERK激酶活性報(bào)告基因(EKAR4)的方法，發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑處理顯著降低了細(xì)胞核內(nèi)外磷酸化ERK（pERK）的水平，并減少了ERK底物MYC的表達(dá)。

進(jìn)一步分析ERK依賴的磷酸化蛋白質(zhì)組，揭示了ERK調(diào)控的磷酸化蛋白在亞細(xì)胞水平上的不同分布和變化，這些蛋白與細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期、細(xì)胞復(fù)制、RHO GTP酶信號(hào)傳導(dǎo)和RTK激活等關(guān)鍵細(xì)胞過程相關(guān)。特別是，這些磷酸化蛋白中富含ERK對(duì)接序列（如DEF和D基序）和磷酸化基序[S/T]-P，這些序列對(duì)于ERK與底物的特異性結(jié)合和親和力至關(guān)重要。通過構(gòu)建并表達(dá)ERK1/2突變體，進(jìn)一步揭示了ERK與D和DEF基序的相互作用在介導(dǎo)ERK信號(hào)傳導(dǎo)以及對(duì)KRAS依賴生長(zhǎng)的重要性。

圖3：ERK磷酸化蛋白組調(diào)節(jié)由富含ERK結(jié)合基序的蛋白質(zhì)組成的多種功能途徑

四、ERK調(diào)節(jié)一個(gè)復(fù)雜的蛋白激酶網(wǎng)絡(luò)

ERK參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，影響廣泛的蛋白質(zhì)類別，包括表觀遺傳調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄因子和激酶等，這些蛋白的磷酸化狀態(tài)受到ERK的調(diào)控，并驅(qū)動(dòng)ERK依賴的信號(hào)傳導(dǎo)。ERK抑制導(dǎo)致這些蛋白的磷酸位點(diǎn)數(shù)量顯著減少。ERK抑制導(dǎo)致細(xì)胞周期依賴性激酶(CDKs)、MAPKs、糖原合成酶激酶(GSKs)和CDK樣激酶(CLKs)等激酶家族的調(diào)節(jié)失常。特別是，ERK抑制后ERK1和ERK2的基序顯著下調(diào)，而RSKs、MAPKs和CDKs等激酶在長(zhǎng)時(shí)間抑制后也顯示出調(diào)節(jié)失常。同時(shí)，還觀察到一些之前未被確定為ERK的直接靶標(biāo)的激酶，如HIPKs、CLKs和DYRKs，在ERK抑制后補(bǔ)償性活性增加。盡管KRAS可以結(jié)合多個(gè)效應(yīng)子，但ERK和KRAS調(diào)控的激酶之間差異很小，這強(qiáng)調(diào)了ERK在KRAS信號(hào)傳導(dǎo)中的核心作用。

圖4：ERK通過參與下游激酶調(diào)控動(dòng)態(tài)磷酸化蛋白質(zhì)組

五、ERK與RHO GTPase信號(hào)高度集成

通過GO、KEGG和Reactome數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)PDAC中ERK依賴的磷酸化蛋白質(zhì)組與ERK通路數(shù)據(jù)庫存在66%重疊，但一致性僅為33%。這些磷酸化蛋白質(zhì)與RHO GTPase信號(hào)通路、染色質(zhì)組織、RNA處理和G1/S細(xì)胞周期等過程顯著相關(guān)，暗示了異常ERK激活在PDAC中的全面作用。進(jìn)一步的研究揭示了短期抑制主要影響RHO GTPase和EGFR/MAPK信號(hào)通路，而長(zhǎng)期抑制則影響細(xì)胞周期和有絲分裂等更廣泛的細(xì)胞過程。特別是，RHO GTPase信號(hào)通路在長(zhǎng)期抑制后由下調(diào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯险{(diào)，提示存在對(duì)ERK抑制的補(bǔ)償機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)分析揭示了三個(gè)與ERK抑制后的磷酸化變化相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，特別是涉及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組調(diào)節(jié)的激酶（如PKN1/2、PAK4/6和PDPK1）。通過免疫熒光顯微鏡評(píng)估，ERK抑制后肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維增加，與磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致，可能與RHO GTPase活性調(diào)節(jié)和YAP1-TEAD激活相關(guān)。

圖5：ERK信號(hào)與RHO GTPase信號(hào)高度集成

六、ERK調(diào)節(jié)PDAC生長(zhǎng)的關(guān)鍵蛋白

通過CRISPR-Cas9技術(shù)，在KRAS突變型PDAC細(xì)胞系中識(shí)別了1636個(gè)具有遺傳依賴性的基因，并在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集中檢測(cè)到690相關(guān)基因，其中超過一半與ERK調(diào)控的磷酸位點(diǎn)有關(guān)。研究進(jìn)一步揭示了這些基因產(chǎn)物在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的分布，并特別關(guān)注了RHO GTPase及其效應(yīng)子，以及RNA代謝和細(xì)胞周期組分（特別是M期和S期）在PDAC生長(zhǎng)中的重要作用。此外，還探討了這些ERK調(diào)控的磷酸化蛋白質(zhì)在KRAS突變型癌癥中的選擇性遺傳依賴性，并發(fā)現(xiàn)了一些在KRAS突變型PDAC中特別關(guān)鍵的基因，如FRA1、MYC和p130CAS。最后，提出了一個(gè)模型，即ERK通過調(diào)節(jié)CDK1激活和細(xì)胞周期S期及M期進(jìn)展的磷酸化蛋白質(zhì)來推動(dòng)PDAC生長(zhǎng)。

圖6：ERK依賴性PDAC磷酸化蛋白質(zhì)組的遺傳依賴性

研究結(jié)論

ERK1和ERK2具有幾乎相同的信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)化輸出，KRAS調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白質(zhì)組幾乎完全由ERK驅(qū)動(dòng)。

在2123種蛋白質(zhì)上鑒定了4666個(gè)ERK依賴性磷酸化位點(diǎn)，其中79%和66%的位點(diǎn)在從前被認(rèn)為與ERK無關(guān)，這大大擴(kuò)展了ERK依賴型磷酸化位點(diǎn)的深度和廣度，并揭示了ERK在癌癥中更復(fù)雜的功能。

確定ERK控制一個(gè)高度動(dòng)態(tài)和復(fù)雜的磷酸化蛋白質(zhì)組，集中于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶調(diào)節(jié)和RHO GTPase。

建立了ERK驅(qū)動(dòng)KRAS-依賴性胰腺癌生長(zhǎng)的最全面的分子圖譜和機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] Klomp JE, Diehl JN, Klomp JA, et al. Determining the ERK-regulated phosphoproteome driving KRAS-mutant cancer[J]. Science, 2024 Jun 7, 384(6700): eadk0850.