RNA與蛋白質(zhì)的相互作用對整個生物學(xué)中的RNA功能至關(guān)重要。通常依賴于親和力純化的傳統(tǒng)策略也傾向于檢測高親和力相互作用，可能會錯失一些具有生物學(xué)重要性的較弱相互作用。

2024年2月，來自杜克大學(xué)化學(xué)系的Amanda E. Hargrove教授和Michael C. Fitzgeral教授課題組將穩(wěn)定性的質(zhì)譜法首次應(yīng)用在分析RNA-蛋白相互作用中，該成果在“Stability-Based Proteomics for Investigation of Structured RNA?Protein Interaction”（Analytical Chemistry ， IF 7.4  ）一文中展示。本文報道了SPROX（蛋白質(zhì)氧化率穩(wěn)定性）和TPP（熱蛋白組學(xué)）方法用于研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的創(chuàng)新適應(yīng)和評估結(jié)果，還證明了SPROX和TPP方法的正交性。這項工作為全球發(fā)現(xiàn)和詢問RNA-蛋白質(zhì)相互作用建立了一個新的平臺，可推廣到許多生物環(huán)境和RNA靶點。

文章標(biāo)題：Stability-Based Proteomics for Investigation of Structured RNA?Protein Interactions

發(fā)表期刊：analytical chemistry

影響因子：IF 7.4

發(fā)表時間：2024年2月 

研究策略

樣本策略：

• 發(fā)現(xiàn)結(jié)合蛋白：用LNCaP細胞核裂解液進行4次重復(fù)TPP、SPROX實驗并篩選結(jié)合蛋白；

• 驗證結(jié)合蛋白：用LNCaP細胞核裂解液進行RNA pull down并LC-MS/MS分析。

技術(shù)手段：TPP、SPROX、RNA-protein pull down-LC-MS/MS、圓二色譜、蛋白質(zhì)印跡（WB）

文章摘要 

1. 用SPROX和TPP方法研究三種不同結(jié)構(gòu)（一級、二級和三級）的RNA及其對LNCaP細胞核裂解液中蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定性的影響；

2. 用傳統(tǒng)的pull down實驗與TPP、SPROX實驗結(jié)果對比，對蛋白檢測情況進行分析；

3. 用WB-TPP進行驗證已知的RNA-蛋白質(zhì)互作關(guān)系。

圖 本研究工作流

結(jié)果速遞

一、SPROX和TPP分析

在本研究中，使用圖1所示的實驗工作流程，在存在和不存在三種RNA配體的情況下，對LNCaP細胞核裂解液中的蛋白質(zhì)進行SPROX和TPP的系列實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TPP中測定的蛋白質(zhì)的70%以上可以在SPROX分析中測定，只有SPROX中測定的32%的蛋白在TPP中測定（圖2）。對于TPP，溫度設(shè)置在37到64°C之間，SPROX，變性劑尿素濃度設(shè)置為0到5.5 M之間。由于這些不同結(jié)合實驗中的溶液條件可能會改變RNA的折疊，并且熱量和尿素會誘導(dǎo)不同的RNA構(gòu)象變化，致使在SPROX和TPP實驗中觀察到的大量獨有蛋白。文章用TH RNA配體處理的樣本進行了圓二色譜（CD）實驗來探索溫度和尿素的變性條件引起的構(gòu)象變化（圖3），結(jié)果顯示通過不同溫度點、尿素濃度點CD信號的改變，TPP中所用的熱量可能會誘導(dǎo)顯著的TH去折疊，進而改變與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的結(jié)合。

圖1：TPP和SPROX工作流（左）；三種RNA配體結(jié)構(gòu)（右上）；SPROX和TPP技術(shù)獲得的蛋白質(zhì)組覆蓋率（右下）

圖2：TPP和SPROX兩種實驗?zāi)Ｊ较聶z測的蛋白重疊情況

圖3：圓二色譜

二、pull down實驗、TPP、SPROX實驗結(jié)果對比

作者進行了常規(guī)的RNA-蛋白質(zhì)下拉實驗，用3′-去硫生物素化的TH RNA配體和LNCaP細胞核裂解液中的蛋白質(zhì)進行了共孵育，將該方法結(jié)果與上述兩種實驗進行對比。TH下拉實驗中確定的108個蛋白質(zhì)中，約有15%與TPP和SPROX確定的命中重疊（圖4B）。在SPROX實驗中發(fā)現(xiàn)了最多的重疊（10個蛋白質(zhì)SPROX:下拉，4個蛋白質(zhì)TPP:下拉）。如上所述，TPP和下拉實驗之間的這種有限重疊可能是由于下拉方法中使用的溫度（4°C）比TPP更低。然而，同樣值得注意的是，ILF3和HNRNPA1在所有三種方法中都被采樣并確定為命中。如上所述，這兩種蛋白質(zhì)是已知的TH結(jié)合物。

圖4：三種檢測結(jié)果的overlap

三、富集分析

將實驗中檢測到的蛋白進行了富集分析，發(fā)現(xiàn)TH、PolyU和SL蛋白命中在RNA結(jié)合蛋白中最顯著（圖5A）。另外還富集在與RNA相關(guān)的其他分子功能上，如異源和有機環(huán)狀化合物結(jié)合和核酸結(jié)合，富集分析的結(jié)果提供了證據(jù)，證明SPROX和TPP可以鑒定三級、二級和一級RNA結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白。使用UniProt ID映射軟件和PFam數(shù)據(jù)庫，作者還研究了SPROX映射中含蛋氨酸的肽命中到其各自蛋白質(zhì)內(nèi)先前注釋的結(jié)構(gòu)域的一致性。在TH的74個蛋白質(zhì)帶有注釋的結(jié)構(gòu)域(RNA-binding domains (RBDs))，這74種蛋白質(zhì)由98個含蛋氨酸的肽命中表示，其中66個含甲硫氨酸的肽中有49個被定位到已知的RBD，這表明TH RNA和這些蛋白質(zhì)相互作用體具有新的相互作用表面。這些定位的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括RNA識別基序（RRM）（21肽）、解旋酶結(jié)構(gòu)域（7肽）、雙鏈RNA結(jié)合基序（DRBM）（5肽）和其他RBD（16肽），包括SAP結(jié)構(gòu)域、58個S4 RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)、59個和NTF2結(jié)構(gòu)域60（圖5B）。將同樣的分析應(yīng)用于PolyU配體命中，130個含蛋氨酸的肽命中產(chǎn)生了31個肽，這些肽映射到17種不同蛋白RBDs，包括HuR中的RBD。

在SPROX和TPP實驗的共有蛋白中，15種蛋白質(zhì)中有5種具有沉積在PDB中的3D結(jié)構(gòu)，其中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域與RNA復(fù)合，并且RNA結(jié)合界面被解析。其中包括來自TH實驗的HNRNPC/C1、HNRNPA1和ILF3、來自PolyU實驗的HuR以及來自SL實驗的SRSF1。在檢查這些結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)所有映射的肽都位于RNA結(jié)合位點附近。雖然受到可用結(jié)構(gòu)的限制，但該分析驗證了SPROX從參與特定結(jié)構(gòu)RNA識別的RBD中鑒定肽的傾向。這也表明SPROX不僅可以用于鑒定新的RNA結(jié)合蛋白，還可以用于鑒定新型RBD。

圖5：富集分析及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

四、WB-TPP分析

作者利用WB-TPP工作流程來證實在TPP-MS實驗中檢測到的選定的RNA-蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用。這些實驗對HuR和TH、PolyU和SL、PABP1和Sam68與TH配體進行的WB分析，且WB 與TPP結(jié)果保持一致。另外使用WB-TPP來表征METTL16與三種測試配體的結(jié)合，METTL16在TPP或SPROX實驗中沒有得到有效的測定，METTL16在TH下拉實驗中被檢測為命中。Pull down的一個優(yōu)點是，在親和選擇步驟中，可以有效地濃縮測試樣品中以低豐度存在的潛在命中蛋白（即本工作中的核裂解物），最終使它們更容易在自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)讀數(shù)中檢測到，因為它們的離子信號不太可能被測試樣品中的其他蛋白質(zhì)掩蓋。WB-TPP方法的一個優(yōu)點是，來自較不豐富蛋白質(zhì)的信號不會被測試樣品中較豐富蛋白質(zhì)的那些信號掩蓋。

研究結(jié)論

基于親和力的pull down和穩(wěn)定性方法（TPP和SPROX）都有助于在蛋白質(zhì)組規(guī)模上識別強烈的、直接的RNA-蛋白質(zhì)相互作用，只是基于穩(wěn)定性的方法更具有優(yōu)勢，因為不需要特別標(biāo)記的RNA，能提供間接相互作用的信息，如RNA處理后蛋白質(zhì)組內(nèi)可能發(fā)生的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和構(gòu)象改變等。這些方法有可能為靶向特定RNA-蛋白質(zhì)交互作用的小分子療法的發(fā)展提供見解。