金屬結(jié)合蛋白(Metal-binding proteins, MBPs)在所有生物體中具有多種重要的生物學(xué)作用。有報道稱，許多人類疾病，如神經(jīng)退行性疾病和癌癥，與功能失調(diào)的MBPs密切相關(guān)。盡管目前研究人員已開發(fā)出多種代表性方法來探索蛋白質(zhì)組中的金屬結(jié)合蛋白，包括電感耦合等離子體質(zhì)譜 (ICP-MS)、固定金屬親和層析（IMAC）、基于活性的蛋白質(zhì)分析 (ABPP) 和金屬同位素天然放射自顯影 (MIRAGE) 等，但全面了解金屬離子與哪些蛋白質(zhì)結(jié)合以及這些結(jié)合對生物功能的影響仍然具有挑戰(zhàn)。
近日，北京大學(xué)的王初課題組與肖俊宇課題組合作在Nature Chemical Biology（IF=14.8）雜志上發(fā)表了題為“Discovery of metal-binding proteins by thermal proteome profiling”的研究文章。文章中報道了一種名為“熱蛋白質(zhì)組分析記錄的金屬提取觸發(fā)攪拌”(METAL-TPP)的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，采用熱蛋白質(zhì)組學(xué)（TPP）分析技術(shù)在蛋白質(zhì)水平研究金屬解離誘導(dǎo)的蛋白熱穩(wěn)定性擾動。
熱蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要原理是基于有無配體結(jié)合蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性差異來確定靶蛋白。同時，許多研究發(fā)現(xiàn)金屬離子的結(jié)合能夠增加MBPs的熱穩(wěn)定性，基于該理論基礎(chǔ)，研究人員使用螯合劑從MBPs中提取金屬，并通過熱蛋白質(zhì)組分析監(jiān)測由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性變化，開發(fā)了基于熱穩(wěn)定性變化發(fā)現(xiàn)金屬結(jié)合蛋白的新方法并對蛋白質(zhì)組中的MBPs進(jìn)行全局分析。
文章標(biāo)題：Discovery of metal-binding proteins by thermal proteome profiling
發(fā)表期刊：Nature Chemical Biology
影響因子：14.8
發(fā)表時間：2024年2月26日
發(fā)表單位：北京大學(xué)
METAL-TPP的假設(shè)是基于MBPs會因?yàn)榻饘俳怆x后穩(wěn)定性發(fā)生變化從而通過TPP技術(shù)鑒定出來。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員選擇三個已知的MBPs，山梨醇脫氫酶（SORD）、α-烯醇化酶（ENO1）、凝膠素（GSN）分別結(jié)合鋅、鎂和鈣，以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為非MBP對照并使用廣譜的金屬離子螯合劑EDTA進(jìn)行處理（圖1a）。正如預(yù)期，EDTA處理后三種MBPs的Tm值均顯著向較低溫度偏移，而GAPDH的熱穩(wěn)定性沒有受到影響（圖1b）。結(jié)果證實(shí)了EDTA是一種有效的螯合劑，可以從MBPs中剝離金屬使其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。
圖1：METAL-TPP的設(shè)計與驗(yàn)證
為了進(jìn)一步測試METAL-TPP是否能在復(fù)雜的蛋白質(zhì)組中起作用，研究人員用EDTA或PBS處理HeLa細(xì)胞裂解液，結(jié)果再次證明METAL-TPP能夠有效地檢測金屬結(jié)合蛋白熱穩(wěn)定性的降低（圖1c）。
接下來，研究人員將基于質(zhì)譜的TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與METAL-TPP結(jié)合來系統(tǒng)分析人蛋白質(zhì)組中的MBPs（圖2a）。結(jié)果顯示SORD、ENO1、GSN和GAPDH基于質(zhì)譜鑒定的熱穩(wěn)定性變化與凝膠實(shí)驗(yàn)中觀察到的熱穩(wěn)定性變化基本一致。生信分析顯示有125個蛋白的熱穩(wěn)定性顯著降低，其中102個（占比82%）是已知的金屬結(jié)合蛋白，注釋分析顯示鑒定的MBPs的金屬類型分布與人數(shù)據(jù)庫中注釋的MBPs分布無顯著差異，表明METAL-TPP對金屬類型無偏好性（圖2b-e）。并且發(fā)現(xiàn)了17個此前未被功能注釋的潛在金屬結(jié)合蛋白（圖2f）。
圖2：METAL-TPP對人蛋白質(zhì)組中的MBPs全局分析
17個潛在的MBPs中，谷氨酰胺果糖6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶（GFPT2）引起研究人員重視。GFPT1/2 是己糖生物合成途徑的第一步限速酶， UDP-GlcNAc 是該通路的最終產(chǎn)物（圖3a）。這些蛋白的功能障礙與2型糖尿病以及各種類型的癌癥密切相關(guān)。因?yàn)镚FPT1和GFPT2之前沒有被注釋為MBPs，那么它們是否能結(jié)合哺乳動物細(xì)胞中的金屬并調(diào)節(jié)酶的功能？研究人員通過一系列實(shí)驗(yàn)證明在活細(xì)胞水平鋅離子會和GFPT2發(fā)生相互作用，抑制該蛋白的活性（圖3b-c）。同時鋅離子的存在會使 UDP-GlcNAc的水平顯著降低（圖3d），說明鋅離子能夠通過抑制 GFPT2的活性調(diào)控己糖生物合成途徑。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)GFPT2對鋅抑制比GFPT1更敏感(圖3e-f)。
圖3：鋅能結(jié)合并抑制人類的GFPT酶
研究人員純化了GFPT2在大腸桿菌中的同源蛋白GlmS，等溫滴定量熱法（ITC）證明 GlmS是鋅離子結(jié)合蛋白（圖4a）。晶體結(jié)構(gòu)顯示GlmS-C的同型二聚體與三個鋅離子結(jié)合（圖4b-d），且其結(jié)合位點(diǎn)與Glms與底物果糖6-磷酸的位點(diǎn)靠近（圖4f），這是鋅可以抑制Glms活性的可能原因之一。
圖4：鋅結(jié)合GlmS的結(jié)構(gòu)和功能表征
除了EDTA外，研究人員還將另一種金屬螯合劑TPEN應(yīng)用于人類蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示150個熱穩(wěn)定性降低的蛋白質(zhì)中有110個為已知金屬結(jié)合蛋白(圖5a)，這110個已知的MBPs中有95個（86%）是鋅結(jié)合蛋白，而基于EDTA的分析中只有41%（102個中的42個）是鋅結(jié)合蛋白（圖5b）。與鎂結(jié)合的ENO1和鈣結(jié)合的GSN相比，兩種鋅結(jié)合MBPs（SORD和TRAF2）的熱穩(wěn)定性顯著降低（圖5c-d）。剩余40個潛在金屬結(jié)合蛋白中，研究人員選擇了其中一個靶點(diǎn)蛋白GPATCH11進(jìn)行了初步生化驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該蛋白是一個鋅離子結(jié)合蛋白（圖5f）。
圖5：TPEN應(yīng)用METAL-TPP分析人鋅結(jié)合蛋白
綜上，研究人員開發(fā)了全新的鑒定金屬結(jié)合蛋白的方法（METAL-TPP），利用EDTA和TPEN兩種不同類型的金屬螯合劑對MBPs進(jìn)行擾動，并結(jié)合TPP熱蛋白質(zhì)組學(xué)全面探究了人源MBPs。這一創(chuàng)新性方法為深入探究MBPs的功能和機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具，并為金屬在細(xì)胞生物學(xué)中的功能研究提供了豐富的資源。
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